Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le regioni genomiche bersaglio di KDM five a Jared one, una istone demetilasi RBB two. Questo viene ottenuto preparando cromatina cross-linkata che viene sonificata per produrre frammenti di DNA di dimensioni appropriate come secondo passaggio. I frammenti di DNA legati a RBB two vengono immunoprecipitati con anticorpi specifici per RBB two.

Successivamente, il DNA genomico recuperato viene amplificato mediante PCR per il sequenziamento. Infine, le letture brevi ottenute con Illumina vengono allineate in modo univoco al genoma umano e i picchi significativi vengono identificati e annotati ai geni più vicini. Al fine di identificare rbbb due geni bersaglio, si ottengono risultati che mostrano funzioni molecolari associate ai geni bersaglio di Rrb B due, basati sull'identificazione su scala genomica delle regioni arricchite per Rbbb due.

Ciao, sono Mike. Lei proviene dal laboratorio della dottoressa Elizabeth Bencia del Dipartimento di Biochimica e Genetica Molecolare dell'Università dell'Illinois a Chicago. E io sono ala dal laboratorio di Genomica Biomedica guidato dalla dottoressa NGA presso il Parco di Ricerca Biomedica BARCEL, Università PO P fea.

E io sono Danielle Dal. E io sono William Richter. Entrambi facciamo anche parte del Benevolence Skill Lab.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'immunoprecipitazione della cromatina e il sequenziamento. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il sito di legame del suo dermatologo. Quindi cominciamo.

Per iniziare questa procedura, coltivare circa 10 alla ottava cellule. Per ogni immunoprecipitazione o ip. Qui, linfoma osteolitico diffuso.

Si utilizzano cellule U 937 e si inducono alla differenziazione monocitica con TPA per 96 ore, successivamente alla crescita cellulare, aggiungendo direttamente alla media una soluzione di formaldeide fino a una concentrazione finale dell'1%. Quindi si agita brevemente il flacone e si lascia a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente si aspira la media e si risciacquano le cellule con 15 millilitri di PBS freddo sul ghiaccio. Ripetere questo lavaggio una volta.

Successivamente, aggiungere sei millilitri di buffer di lisi uno a ciascun matraccio posto sul ghiaccio. Quindi agitare i matracci per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Infine, raccogliere le cellule utilizzando una spatola per cellule e trasferirle in provette coniche da 15 millilitri.

A questo punto, le cellule possono essere conservate a meno 80 gradi Celsius. Se le cellule sono state congelate, scongelarle. Una volta scongelate, centrifugare le cellule e scartare il soprannatante.

Quindi risospendere le cellule in sei millilitri di buffer di lisi due, agitare delicatamente i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere la centrifugazione e risospendere le cellule in 2,5 millilitri di buffer di lisi tre. Successivamente, preparare la sospensione per la sonificazione ponendola in un becher contenente acqua ghiacciata con la micropunta di un sonicator Branson 450 impostato tra il 50 e il 60% di ampiezza.

Sonicare la soluzione per un'esplosione costante di 32 secondi e raffreddare in ghiaccio. Ripetere questi impulsi da 10 a 15 volte per un minuto, quindi aspirare e dispensare il contenuto del tubo su e giù e trasferirlo in un nuovo tubo. Continuare a inviare impulsi e raffreddare la soluzione.

Un'ulteriore cinque volte dopo la sonificazione, aggiungere Triton X-100 al 10% a un decimo del volume della soluzione. Successivamente, trasferire i lisati in provette da centrifuga da 1,5 millilitro e rimuovere i detriti mediante centrifugazione in una microcentrifuga prima della cromatina, immunoprecipitazione o chip. Conservare 50 microlitri del lisato cellulare come campione di input.

Quindi, combinare il lisato cellulare chiarificato con le perle Dyna legate all'anticorpo, preparate in precedenza come descritto nel protocollo scritto. Agitare la miscela insieme al campione di input di 50 microlitri a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare le perle con un millilitro di buffer di lavaggio.

Quindi utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perle e rimuovere il soprannatante. Ripetere questo lavaggio da sei a otto volte. Eseguire un lavaggio finale con un millilitro di TE aggiunto di cloruro di sodio 50 millimolare.

Centrifugare le perle in una microcentrifuga, quindi aspirare qualsiasi residuo di tampone TE. Aggiungere poi 100 microlitri di tampone di eluizione ai campioni. Immediatamente dopo.

Incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 10-15 minuti. Graffiare i tubi contro un supporto per tubi da 1,5 millilitri ogni due minuti per mantenere le perle in sospensione. Raccogliere le perle mediante centrifugazione e l'utilizzo del supporto magnetico e trasferire il SNAT in un tubo PCR.

Quindi recuperare il campione iniziale precedentemente conservato e aggiungere tre volumi del buffer di eluizione. Infine, inserire i campioni di IP e del campione iniziale nel termociclatore per tutta la notte a 65 gradi Celsius. Per invertire i legami incrociati il giorno successivo, aggiungere un volume di buffer TE ai campioni.

Quindi aggiungere l'RNA A a una concentrazione finale di 0,2 microgrammi per microlitro. Incubare i campioni nel termociclatore per uno o due ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 0,2 microgrammi per microlitro.

Quindi incubare i campioni nel termociclatore a 55 gradi Celsius per due ore. Successivamente, estrarre i campioni una volta con un volume di fenolo. Estrarre i campioni una seconda volta con un volume di alcol fenil cloroformico isoamilico.

Estrarre infine i campioni un'ultima volta con un volume di cloroformo alcol isoamilo. Aggiungere quindi 30 microgrammi di glicogeno a ciascun campione. Aggiungere inoltre cloruro di sodio fino a una concentrazione finale di 0,2 molare e due volumi di etanolo ai campioni.

Incubare per 30 minuti a meno 80 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni e decantare il surnatante. Lavare i pellet con 500 microlitri di etanolo al 75%, quindi asciugare i pellet e risospendere in 40 microlitri di acqua.

Per verificare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di SONICAZIONE, caricare cinque microgrammi del campione in ingresso purificato su un gel di agarosio all'1,8% ed eseguire l'elettroforesi. La procedura di sonicazione dovrebbe produrre frammenti compresi tra 150 e 350 paia di basi. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere ottimizzata variando il numero di impulsi e l'ampiezza prima dell'amplificazione del DNA genomico.

Verificare le dimensioni, la concentrazione e l'arricchimento dei campioni come descritto nel protocollo scritto. Per iniziare l'amplificazione del DNA genomico, ottenere 34 microlitri del campione IP e 200 nanogrammi del campione di input. Eseguire e riparare l'aggiunta di una coda poli-A e la ligazione degli adattatori ai frammenti di DNA utilizzando un kit di preparazione del DNA genomico Illumina come descritto nel protocollo scritto.

Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR mini colonna e quindi eluirlo nel buffer EB preriscaldato a 50 gradi Celsius. Utilizzare rispettivamente 23 microlitri e 46 microlitri per i campioni di DNA IP e di input. Preparare la reazione PCR utilizzando 23 microlitri di DNA con adattatori, 25 microlitri di fusione e la DNA polimerasi del kit.

Un microlitro di PCR unico a 20 micromolare e un microlitro di PCR due a 20 micromolare. Eseguire la reazione di PCR come descritto nel protocollo scritto. Dopo l'amplificazione PCR, purificare il DNA con il kit di purificazione PCR Qiagen mini loop.

Riscaldare in anticipo 15 microlitri di tampone EB a 50 gradi Celsius e diluire il DNA diluendo 0,5 microlitri del campione da uno a quattro ed effettuare una lettura con NanoDrop per purificare i prodotti amplificati. Preparare un gel all'1,8% di AGROS da 50 millilitri utilizzando acqua di grado HPLC, aggiungere TAE e bromuro dopo che l'AGROS si è fuso. Quindi versare il gel e caricare il gel.

Dopo aver aggiunto quattro microlitri di buffer di caricamento ai campioni di input e IP, eseguire la corsa elettroforetica su gel a 120 volt per 45 minuti. Analizzare il gel al termine della corsa. I risultati dovrebbero mostrare che vengono prodotti frammenti con una dimensione compresa tra 150 e 350 paia di basi.

Rappresentano frammenti di DNA genomico compresi tra 50 e 250 paia di basi in lunghezza. E con un bisturi asportare la regione del gel contenente il materiale nell'intervallo da 150 a 350 paia di basi. Prestare attenzione a evitare l'asportazione della banda dell'adattatore, che migra a circa 120 paia di basi.

Recuperare il DNA utilizzando un kit di estrazione rapida da gel kayak seguendo le istruzioni del produttore. Essiccare il campione fino a un volume preciso di 11 microlitri in uno speed back senza riscaldamento. Prelevare un microlitro del campione e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.

Infine, identificare i prodotti genici arricchiti utilizzando l'analizzatore genomica Illumina e analizzare i siti di legame e i geni bersaglio come descritto nel protocollo scritto. Le coordinate genomiche delle regioni di legame delle proteine leganti l'RNA, arricchite, identificate come RB binding protein two o RBP two, sono presentate in un formato suddiviso per cromosoma. Le occupazioni dei geni ensemble nei cromosomi possono essere visualizzate come VAR neri.

Qui sono mostrate le occupazioni del cromosoma 10; due regioni di legame dell'RBP due sono indicate come linee verticali. Il pannello centrale mostra tutte le regioni di legame delle isoforme dell'RBP due sul cromosoma 10, mentre il pannello inferiore mostra le regioni di legame dell'isoforma grande dell'RBP due. Queste informazioni forniscono una panoramica delle occupazioni sovrapposte e specifiche delle isoforme dell'RBP due sul cromosoma 10.

Qui è mostrata una mappa termica con le categorie di funzione molecolare dell'ontologia genica (GO) significativamente arricchite, corrette per il tasso di falsa scoperta (FDR), tra i geni legati da rbp. Due tonalità tendenti al rosso indicano un'elevata significatività statistica. Il giallo indica una bassa significatività statistica, mentre il grigio indica l'assenza di significatività statistica.

L'analisi di arricchimento mostra le funzioni molecolari sovrapposte e specifiche delle isoforme dei geni bersaglio di R BP due. Abbiamo appena mostrato come identificare i siti di legame dei fattori di trascrizione durante questa procedura. È importante produrre frammenti di DNA nell'intervallo di dimensioni appropriato e con resa adeguata.

Questo può essere ottenuto seguendo le nostre linee guida durante il passaggio di SONICAZIONE. Ecco fatto. Buona fortuna con i vostri esperimenti e grazie per averci seguito.