A Novel bayesiano Cambia punto di Algoritmo per Genome-wide analisi di diversi tipi di dati ChIPseq

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sfruttare la densità delle posizioni di lettura mappate ottenute da dati di sequenziamento dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) per stimare la densità media a posteriori delle letture lungo il genoma. Questo viene ottenuto mediante pre-elaborazione. Le letture ChIP-seq mappate vengono convertite in profili di densità suddivisi in blocchi, in cui lo stesso numero di letture cade all'interno di bin non sovrapposti di 200 paia di basi.

Qualsiasi bin adiacente con la stessa densità viene unito in un blocco più grande come secondo passaggio; successivamente, le densità medie a posteriori di ciascun blocco vengono calcolate ricorsivamente nel contesto di tutti i blocchi circostanti, utilizzando un modello bayesiano con filtri forward e backward. Il conteggio delle letture per un blocco è modellato con una distribuzione di Poisson con un parametro theta che assume una distribuzione a priori gamma con parametri alpha e beta. Successivamente, le stime della densità media a posteriori di ciascun blocco vengono valutate per significatività in base al fatto che superino o meno il quantile 90° rispetto alla densità di fondo del controllo di input, al fine di generare i segmenti genomici arricchiti finali. Si ottengono risultati che illustrano il processo dalle letture sequenziate grezze alle stime della densità media delle letture a posteriori, e infine alle isole arricchite nei dati ChIP-seq durante l'analisi BCP.

Inoltre, i risultati mostrano che BCP supera uno strumento concorrente, cer. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come CER è che BCP utilizza i più recenti avanzamenti A nei modelli a marcatori nascosti, consentendo così una caratterizzazione più accurata delle sfumature nell'analisi dei dati chipsy rispetto ai precedenti metodi euristici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epigenomica, come il ruolo delle modifiche istoniche attraverso la caratterizzazione dei loro schemi di arricchimento su scala genomica.

Sebbene questo metodo accurato possa fornire spunti utili per l'analisi dei dati ChIP-seq, la struttura di base può essere applicata anche ad altre analisi di sequenziamento di nuova generazione, come l'identificazione di regioni differenzialmente metilate nei dati di sequenziamento bis-Sufi, nuovi loci di trascrizione nell'RNA-Seq, variazioni del numero di copie o diversi tipi di dati di microarray in tiling. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per comprendere chiaramente la metodologia e i suoi vantaggi. I vantaggi teorici sono nascosti all'interno del software.

Tutti i passaggi procedurali illustrati qui sono stati racchiusi in un singolo eseguibile incluso nel pacchetto software BCP, disponibile per il download in questo video. I passaggi eseguiti dal programma sono descritti per avviare il software. Sono richiesti tre parametri.

Un file contenente letture univocamente mappate provenienti da un campione chip e un file simile per le letture di controllo input, nonché un nome di file di output per preparare i file di input per l'analisi BCP. Innanzitutto, allineare le letture brevi ottenute dai run di sequenziamento al genoma di riferimento appropriato utilizzando il software di allineamento per letture brevi preferito. Le posizioni mappate devono essere convertite nel formato browser extensible data (BED) a sei colonne, con una riga delimitata da tabulazioni per ogni lettura mappata che indichi la posizione iniziale del cromosoma mappato, la posizione finale, il nome della lettura, il punteggio e il filamento.

Estendere le posizioni del chip e della mappa di input a una lunghezza predeterminata del frammento. Ad esempio, la dimensione del frammento mirata durante la digestione enzimatica o la sonificazione del DNA, solitamente intorno a 200 paia di basi. I conteggi dei frammenti vengono quindi aggregati in bin adiacenti.

Per impostazione predefinita, la dimensione del bin è impostata sulla lunghezza stimata del frammento di 200 paia di basi. Eventuali punti di cambiamento in un insieme di bin con conteggi di lettura identici cadranno molto probabilmente ai margini più esterni. Di conseguenza, è improbabile che un punto di cambiamento si verifichi a un confine interno tra due bin con lo stesso numero di letture.

Pertanto, raggruppare i bin adiacenti con lo stesso numero di letture per bin in un singolo blocco. Dopo aver preparato i file di input, richiamare la stima BCP digitando semplicemente il comando mostrato nella parte inferiore dello schermo. La densità delle letture di ciascun blocco è modellata come una distribuzione di Poisson con un parametro medio theta che segue una mistura di distribuzioni gamma con parametri alpha e beta e una probabilità a priori di un punto di cambiamento in qualsiasi blocco.

Il limite di P condiziona ogni blocco in questo modo, rendendo di fatto un modello nascosto di Markov a stato infinito, o HMM. I parametri iper alfa, beta e P vengono stimati utilizzando la massima verosimiglianza a posteriori. Le stime bayesiane vengono calcolate esplicitamente per ogni blocco theta pedice T come valore atteso di theta pedice T dato y pedice T; i più tradizionali, ma più lenti, filtri forward e backward spesso utilizzati negli HMM vengono sostituiti con un'approssimazione a mescolanza di complessità limitata, computazionalmente più efficiente, per stimare le medie a posteriori theta stimato pedice T. Le medie a posteriori risultanti verranno regolarizzate in un profilo approssimativamente costante a tratti, pertanto i blocchi con lo stesso theta stimato pedice T dovrebbero essere ulteriormente raggruppati insieme, con coordinate dei limiti aggiornate.

BCP utilizza il numero di letture in ingresso per blocco come tasso di fondo e determina l'arricchimento. Mediante un semplice test d'ipotesi basato sul fatto che la densità media della posizione chip per un blocco superi una certa soglia di significatività. Il quantile 90° è la soglia predefinita ed è appropriata nella maggior parte dei casi.

BCP unisce quindi blocchi adiacenti di densità media posteriore che superano l'arricchimento in una singola regione e riporta le coordinate unite nel browser. Il formato di dati estensibile BCP è particolarmente efficace nell'identificare regioni di ampio arricchimento nei dati di modificazione istonica. Qui, i risultati di BCP vengono confrontati con quelli di cser, uno strumento esistente che ha dimostrato ottime prestazioni; lavori precedenti di questo laboratorio, nello studio della trimetilazione dell'H tre K 36, hanno mostrato una tendenza a dimensioni delle isole molto maggiori in BCP rispetto a cer.

Le isole più grandi sono più in linea con l'aspettativa convenzionale di isole ampie e diffuse di arricchimento della trimetilazione di H3K36. Tuttavia, la sola presenza di isole più grandi non indica accuratezza. Pertanto, è stata utilizzata l'associazione nota tra le isole di trimetilazione di H3K36 e i corpi genici attivamente trascritti, nonché la loro mutua esclusione con le isole di trimetilazione di H3K27, per valutare le prestazioni di BCP e CER rispetto a CER. BCP ha identificato isole contigue più grandi che rappresentano meglio i corpi genici, senza compromettere un maggiore sovrapposizione con le isole di trimetilazione di H3K27.

BCP mantiene l'elevato sovrapposizione di geni attivi mediante isole di trimetilazione dell'H tre K 36, con confini strettamente allineati ai corpi genici, senza aumentare il grado di sovrapposizione falsamente positiva con geni nello spazio intergenico associati a trascrizione repressa o al marcatore repressivo di trimetilazione dell'H tre K 27. Valutando la riproducibilità delle chiamate di isole BCP in due set di dati replicati, si è osservato che BCP non presenta una forte dipendenza dalla profondità di copertura del reed, a differenza dell'algoritmo concorrente cser. Un'ulteriore evidenza della robustezza e riproducibilità di BCP è fornita dall'analisi di ulteriori regioni distinte, che dimostrano confini di isole consistenti nonostante la ridotta profondità di copertura. Per dimostrare pienamente la versatilità di BCP, è stato ottenuto un ampio spettro di dati relativi a modificazioni istoniche, inclusi i marcatori puntiformi di acetilazione dell'H tre K 27, acetilazione dell'H tre K nove e trimetilazione dell'H tre K quattro, e il marcatore diffuso di trimetilazione dell'H tre K nove, oltre alla trimetilazione dell'H tre K 27 e alla trimetilazione dell'H tre K 36. Questi set di dati sono stati analizzati utilizzando le impostazioni predefinite dei parametri sia per BCP che per cser.

Al centro si trova l'arricchimento di trimetilazione H3K36 nel gene PXDN, che indica trascrizione attiva; come previsto, nel sito di inizio della trascrizione sono presenti ulteriori marcatori attivi puntiformi: acetilazione H3K27, acetilazione H3K9 e trimetilazione H3K4. Appena a valle di PXDN si estende una regione intergenica repressa, contrassegnata dall'arricchimento di trimetilazione H3K27; sull'opposto versante si trova un gene represso marcato da trimetilazione H3K27. Procedendo ancora di un passo verso l'esterno.

Il nostro cromatina silenziata, indicata dalla presenza di arricchimento di trimetilazione di H3K9, sembra indicare il silenziamento di SN TG2 e MYT1L, forse in modo meno transitorio rispetto alla repressione mediata dalla trimetilazione di H3K27. Questa regione comprende la maggior parte dei fenomeni riscontrati nell'analisi ChIPseek delle modifiche istoniche. Illustra come la natura dinamica del BCP possa identificare sia segni di acetilazione puntiforme che di trimetilazione di H3K4, distinguendo al contempo ampie isole contigue di repressione associate alla trimetilazione di H3K27 e di H3K9, nonché alla trimetilazione di H3K36 correlata alla trascrizione attiva.

Questo algoritmo può essere eseguito in circa 30 minuti, a seconda del numero di letture e del risultato dei segni del genoma. Non è richiesta alcuna ottimizzazione significativa, come spesso avviene con altri metodi, seguendo questa procedura. Utilizzando BBCP, è possibile studiare molte diverse proteine bersaglio dell'immunoprecipitazione della cromatina, inclusi vari altri tipi di modificazioni istoniche nonché fattori di trascrizione leganti il DNA, per rispondere ad ulteriori domande sui meccanismi epigenomici e sulla regolazione genica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come il BCP venga utilizzato per identificare le regioni accessibili ai marcatori istonici diffusi nell'analisi dei dati ChIP-seq.