Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

La nostra esperienza visiva inizia quando il pigmento visivo nei fotorecettori retinici assorbe i fotoni di energia luminosa, portando infine alla chiusura dei canali attivati da nucleotidi ciclici nella membrana cellulare. Questo sopprime il rilascio del neurotrasmettitore glutammato sia dai bastoncelli che dai coni. Il glutammato rilasciato viene rilevato dalle cellule retiniche a valle per lo studio dei segnali a valle.

Gli occhi vengono rimossi da un topo sottoposto a eutanasia. I S vengono isolati, inclusi in un blocco di agar e tagliati utilizzando un microtomo vibrante. Successivamente, le sezioni retiniche vengono posizionate sotto un microscopio e stimolate con illuminazione a LED.

Mentre si effettuano registrazioni con il metodo del patch clamp per misurare le correnti o i potenziali sinaptici generati, le persone nuove rispetto a questa tecnica incontrano generalmente difficoltà a causa delle complessità aggiuntive legate al lavoro al buio. Pertanto, poter visualizzare l'intero processo fornisce una sensazione che altrimenti sarebbe difficile da descrivere.

Iniziare questa procedura rivestendo gli elettrodi a filo di registrazione e di riferimento che verranno utilizzati con uno strato di cloruro d'argento. Immergere gli elettrodi in cloruro di sodio uno molare. Quindi, utilizzando una fonte di alimentazione da 15 volt con un'onda sinusoidale da un hertz, applicare 15 volt tra di essi per circa 20 secondi.

Utilizzando un tiratore di micropipette, preparare le pipette per il patching a partire da vetro in silice BO lucidato a fiamma, scegliendo una resistenza della punta della pipetta in base alle dimensioni delle cellule bersaglio, per corpi cellulari di circa 20 micron di diametro. Utilizzare una pipetta con una resistenza della punta compresa tra cinque e dieci megaohm per i corpi cellulari. Per cellule con un diametro di circa cinque micron, utilizzare una resistenza della punta compresa tra 12 e 15 megaohm.

Per preparare gli elettrodi di riferimento a terra, utilizzare una siringa per riempire un tubo di polietilene con una soluzione di agar al 3,5% preparata in cloruro di sodio un millimolare. Successivamente, preparare le seguenti soluzioni seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato: soluzione esterna per il bagno, soluzione per il taglio, soluzione interna per la pipetta a base di aspartato di potassio e il tampone di agar.

Conservare tutte le soluzioni a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Il giorno dell'esperimento, prelevare circa 1,5 millilitri di soluzione interna di aspartato di potassio. Quindi aggiungere Fluor diluito.

Versare circa 50 millilitri di mezzo aims contenente bicarbonato di sodio nel contenitore di stoccaggio impermeabile alla luce. Collegare il tubo di plastica a una bombola di gas contenente il 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno per equilibrare il mezzo aims con il gas, quindi collocare il contenitore in un bagno d'acqua a una temperatura compresa tra 30 e 32 gradi Celsius. Successivamente, riempire una bottiglia con 110 millilitri di mezzo aims contenente gli hPEAS e posizionarla sul ghiaccio.

Equilibrare il mezzo facendo gorgogliare la soluzione con gas ossigeno al 100%. Collocare il mezzo aimes rimanente contenente bicarbonato di sodio in un serbatoio riscaldato posto sopra la gabbia di Faraday. Avvolgere il paraformaldeide attorno al tubo e al tappo della bottiglia per trattenere il gas nello spazio sopra la soluzione ed equilibrare con una miscela di gas al 5% di anidride carbonica e 95% di ossigeno.

Utilizzando un tubo di dispersione dell'aria in vetro, preparare l'agarosio a bassa temperatura di gelificazione al 3% aggiungendo 0,75 grammi a 25 millilitri di mezzo aims con riscaldamento intenso. La soluzione raggiunge una temperatura di circa 115 gradi Celsius durante l'agitazione. Quando la soluzione diventa limpida e priva di bolle, versare la soluzione di agarosio fuso in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius.

Impostare la camera di registrazione sul microscopio invertito. Far scivolare un ponte di agar di cinque centimetri sull'elettrodo di riferimento al argento/cloruro di argento e posizionarlo nella camera di registrazione. La resistenza della punta della pipetta può essere misurata riempiendo una pipetta con soluzione interna, posizionandola sul supporto della pipetta, inserendo il supporto nella testa dell'amplificatore e abbassando la pipetta nella soluzione; per preservare il pigmento visivo durante le registrazioni fisiologiche, tutte le procedure devono essere eseguite alla luce infrarossa utilizzando occhiali a infrarossi, ma tutte le procedure saranno mostrate qui alla luce ambiente.

Dopo aver soppresso il topo, utilizzare forbici curve per rimuovere rapidamente gli occhi. Posizionare gli occhi su un pezzo di carta da filtro per impedire che rotolino. Quindi tenere fermo un occhio con una pinzetta e utilizzare una lama sottile bifacciale per praticare una fessura nella cornea.

Non appena il bulbo oculare viene perforato, trasferire l'occhio in una piastra di Petri da 60 millimetri riempita con mezzo AIMs. Utilizzando la fessura nella cornea come punto di ingresso, usare forbici piccole per rimuovere le parti rimanenti della cornea.

Quindi rimuovere il cristallino e l'umor vitreo, assicurandosi che la retina rimanga attaccata alla coppa oculare. Posizionarla in un contenitore impermeabile alla luce riempito con il mezzo AIMs equilibrato con il 5% di anidride carbonica in ossigeno al 95% a 32 gradi Celsius.

Tagliare successivamente a metà uno dei cupola oculare utilizzando una lama da bisturi numero 10. Separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico.

Rimuovere i bordi della retina per consentire al tessuto di adagiarsi piatto. Utilizzare una piccola pipetta di vetro per pasta con bulbo di lattice per riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con agar fuso a bassa temperatura di gelificazione e trascinare la pinzetta attraverso l'agar per verificarne la consistenza. Una volta che l'agar inizia a solidificare, trasferire la retina sulla superficie dell'agar.

Quindi, senza toccare la retina, utilizzare un pezzo di carta Kim strizzata per assorbire la soluzione in eccesso intorno ad essa. Aggiungere due o tre gocce aggiuntive di agar direttamente sulla retina e posizionare rapidamente un cilindro di plastica per formare una parete intorno ad essa, mantenendo la retina vicino al centro del cilindro; aggiungere ulteriore agar fuso a gocce, quindi trasferire la piastra di Petri in un bagno di acqua ghiacciata per raffreddare. Dopo 30 secondi, rimuovere il tessuto ed utilizzare un pistone per espellere il blocco di agar, spingendo dal lato più lontano rispetto alla retina.

Utilizzare una lametta monouso per ritagliare un piccolo blocco di agar che contenga la retina e fissare il blocco con colla cianoacrilica contro il fermo in agar sul disco del campione. Trasferire il disco del campione sull'apposito albero del microtomo a vibrazione e versare nell'albero abbondante soluzione AIMS fredda, in modo da immergere completamente il blocco contenente la retina. Tagliare sezioni retiniche di spessore pari a circa 200 micron utilizzando la massima velocità di vibrazione della lama e una velocità di avanzamento regolata in modo che siano necessari quattro-cinque secondi per completare il taglio della retina.

Utilizzare una lama di bisturi numero 11 per tagliare ogni sezione utilizzabile dal blocco, una alla volta. Posizionare le sezioni contenenti la retina nelle camere di registrazione e fissarle. Utilizzando gli ancoraggi per sezioni, i fili di nylon attraversano l'ancoraggio per sezioni.

Tenere premuto l'agar intorno alla retina, lasciando la retina libera da ostacoli. Per le registrazioni, trasferire la camera di registrazione sul palco del microscopio eretto.

Chiudere la tenda e accendere la sorgente di luce infrarossa per visualizzare la sezione con una telecamera sensibile agli infrarossi. Al microscopio, identificare una sezione retinica con fotoricettori integri all'angolo di taglio appropriato. Alcuni danni superficiali possono essere evidenti a causa del processo di sezionamento.

Utilizzando una pipetta con la punta rotta, aspirare delicatamente i corpi cellulari morti. Per rimuovere questo sottile strato di cellule, una volta rivelato uno strato sano di cellule vive, identificare un corpo cellulare la cui posizione si trova nello strato di interesse. Spostare la punta della pipetta in modo da creare una leggera depressione nella membrana cellulare ed applicare una pressione negativa o interna delicata per formare un sigillo ad alta resistenza. La modalità a cellula intera può essere ottenuta applicando una pressione negativa all'elettrodo per penetrare all'interno della cellula.

Successivamente, stimolare il tessuto retinico con la luce utilizzando LED per evocare risposte. Alla fine della registrazione, acquisire un'immagine utilizzando la luce di eccitazione appropriata per il fluoroforo che si è dializzato nella cellula dalla soluzione interna della pipetta. Qui vengono mostrati i potenziali evocati dalla luce di un neurone retinico adattato al buio in risposta a impulsi luminosi di intensità crescente.

Questa figura è un'immagine di fluorescenza ottenuta da una sezione retinica in cui le cellule sono state riempite con il fluorocromo Lucifer yellow; la fluorescenza indotta mostra la morfologia delle cellule da cui sono state effettuate le registrazioni in patch. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una comprensione migliore di alcune delle complessità associate all'effettuare registrazioni con tecnica del patch clamp su sezioni retiniche adattate al buio. L'obiettivo di questa procedura è misurare le risposte indotte dalla luce in condizioni di illuminazione controllata.

Per fare ciò, dobbiamo prima isolare la retina, incorporarla in agar e quindi preparare sezioni retiniche da cui possiamo effettuare registrazioni da singola cellula.