Patch-clamp Misure di capacità e Ca ^{2 +} Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Lo scopo generale di questa procedura è preparare sezioni retiniche incluse in agar per lo studio dei microcircuiti localizzati nei terminali nervosi presinaptici delle cellule bipolari. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando la retina da un occhio di pesce rosso adattato al buio e tagliando un piccolo pezzo rettangolare di questa retina. Il frammento retinico viene quindi immerso in una soluzione trasparente di agar a basso punto di fusione, che successivamente viene solidificata in una fresca soluzione per sezioni.

Il passo successivo consiste nel tagliare il blocco solido di agar che contiene il pezzo rettangolare di retina utilizzando un vibratomo. L'ultimo passo è visualizzare, identificare e fare la registrazione. Clampare il terminale nervoso di una cellula bipolare.

In definitiva, i risultati mostrano la corrente calcica pre-sinaptica e l'esocitosi fisica sinaptica con misurazioni della capacità della membrana da terminali di cellule bipolari atomizzati e integri. Ciao, mi chiamo Han Kim. Sono un ricercatore postdottorato nel PCO del laboratorio presso il Burham Institute.

Oggi illustrerò la preparazione di sezioni incluse in AGA della retina fredda del viso e dimostrerò la misurazione della capacità mediante patch clamp su un singolo neurone. Per iniziare questa procedura, emisferizzare ciascun occhio di un pesce rosso tagliando uniformemente intorno alla parte anteriore dell'occhio con un paio di forbici a molla. Successivamente, posizionare le coppette oculari in soluzione fredda per sezioni senza calcio.

Se necessario, rimuovere la lente con pinzette. Successivamente, rimuovere l'epitelio pigmentato aderente alla retina staccando delicatamente la retina dalla coppa oculare mediante un paio di pinzette fini con punta angolata a 45 gradi. Dopodiché, tagliare il nervo ottico utilizzando un paio di pinzette fini o forbici a molla.

Quindi applicare un'aspirazione con una pipetta per pasta modificata o una pipetta per trasferimento con punta grande. Per rimuovere la retina, rimuovere delicatamente il resto dell'epitelio pigmentato ad essa attaccato. La superficie della retina pulita e sana deve apparire liscia.

Quindi trattare la retina isolata con circa lo 0,03% di IDE più elevato per 15-30 minuti a temperatura ambiente. Per rimuovere l'umor vitreo, notare che la procedura deve essere eseguita con poca luce. Nel passaggio successivo, tagliare un pezzo rettangolare di retina di circa due per due millimetri, che comprenda lo spessore completo della retina, rimuovendo i bordi curvi con una lametta.

Quindi trasferire il frammento retinico in un piccolo contenitore riempito con soluzione di agar, cercando di minimizzare la quantità di soluzione attorno alla retina mentre viene posizionata nell'agar liquido. Successivamente immergere la retina con l'agar direttamente nella soluzione fredda per sezioni ghiacciata per far solidificare l'agar. Successivamente, tagliare il blocco di agar solido contenente il frammento retinico rettangolare in un cubo di un centimetro per un centimetro per un centimetro.

Incollare il blocco sulla superficie della piastra di taglio nella camera per fette preco. Quindi tagliare il blocco in fette spesse da 200 a 250 micron nella soluzione fredda di taglio. Utilizzando un vibratomo, si possono ottenere complessivamente da cinque a dieci fette, che rimangono vitali per circa cinque-sei ore.

In seguito, trasferire una delle fette nella camera di registrazione. Posizionare una griglia in platino a forma di U con una rete di fili in nylon sopra la fetta. Perfundere continuamente la fetta a un flusso di uno-due millilitri al minuto con soluzione di registrazione saturata con carbogeno.

In questo passaggio, utilizzare una siringa con un'estremità filtrante da 0,2 micron per riempire la pipetta di vetro per patch con la soluzione interna fino a un livello compreso tra uno e due centimetri dalla parte posteriore della pipetta. Successivamente, rimuovere le bolle d'aria dalla punta. Fissare quindi la pipetta nel supporto.

Applicare una pressione positiva alla pipetta e spostarla verso il terminale bersaglio utilizzando un micromanipolatore, muovendo contemporaneamente la punta verso il basso attraverso la sezione. Muovere la pipetta in direzione laterale a spazzata per assicurarsi che la sezione non venga trascinata insieme alla punta. Successivamente, muovere la punta della pipetta intorno al terminale per pulire la superficie della membrana.

Premere la punta verso il basso contro il bordo del terminale per creare una fossetta e rilasciare la pressione positiva. Se non si forma immediatamente un sigillo gigaohm, applicare una leggera pressione negativa alla pipetta. Una volta formato il sigillo gigaohm, passare l'amplificatore per patch clamp E PC nine alla modalità di registrazione onsell e modificare il potenziale di mantenimento a meno 60 o meno 70 millivolt.

Applicare la correzione rapida della capacità e attendere che il sigillo si stabilizzi tra cinque e dieci gigaohm. Quindi rompere la membrana con una leggera aspirazione decisa. Per stabilire la configurazione di registrazione in modalità "whole cell".

È possibile utilizzare anche l'aspirazione orale al posto di una siringa. Una volta stabilita la configurazione a cellula intera su un terminale MB atomizzato, applicare una depolarizzazione a gradino di 200 millisecondi da meno 70 a zero millivolt. Ricordare che un'onda sinusoidale di due kilohertz in modalità di blocco del voltaggio viene applicata prima e dopo questa depolarizzazione al fine di misurare la capacità della membrana; la depolarizzazione consente la misurazione diretta delle correnti calciche entranti attivate dall'apertura dei canali del calcio di tipo L sensibili al voltaggio, utilizzando una soluzione interna a base di cesio.

Parallelamente, è possibile monitorare il salto di capacità causato dall'esocitosi dipendente dal calcio delle vescicole sinaptiche, che aumenta la superficie della membrana. Se una cellula bipolare MB integra viene perforata con la pipetta sul terminale sinaptico, non verranno osservate correnti di calcio distinguibili a causa delle elevate correnti di perdita dovute al coupling giunzionale nelle reti delle cellule bipolari MB. Ciò che si osserva è una grande corrente di perdita diretta verso l'esterno.

Tuttavia, è ancora possibile monitorare il salto di capacità mediante uno stimolo sinusoidale ad alta frequenza attivato prima e dopo il passo di depolarizzazione mostrato. Di seguito sono riportati esempi di I-R-D-I-C, immagini di terminali di cellule bipolari M. I terminali integri hanno maggiori probabilità di apparire ellittici, come mostrato in A e B, mentre C mostra il terminale misto, che appare rotondo e circolare.

Il metodo di riempimento con colorante può essere utilizzato anche per classificare i terminali cellulari. Di seguito sono riportati esempi di immagini a fluorescenza dei terminali della cellula bipolare MBI con un asse neuritico integro in D, un asse neuritico parzialmente reciso in e e un asse neuritico completamente rimosso in F. I loro terminali sono indicati dalle frecce blu. Qui vengono mostrate le misurazioni dirette dei segnali di imaging del calcio relativi all'esocitosi e al feedback inibitorio.

In un terminale di cellula bipolare MB, un aumento transitorio della concentrazione di calcio nelle telerie di un terminale MB è stato attivato da un passo di depolarizzazione in voltage clamp; l'immagine di fluorescenza corrispondente delle telerie MB è visibile in B. Esempi di depressione sinaptica a breve termine del rilascio di neurotrasmettitore sono mostrati in C. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di minimizzare la quantità di soluzione attorno alla retina quando viene posizionata nell'agar del kit. Questo migliorerà l'adesione della retina dal blocco di agar.