La somministrazione orale di Rotenone utilizzando un Gavage e Image Analysis di alfa-sinucleina inclusioni nel sistema nervoso enterico

I sintomi della malattia di Parkinson, inclusi i disturbi motori e della parola, derivano dalla ridotta attività delle cellule cerebrali che secernono dopamina. Il sistema nervoso enterico e il bulbo olfattivo sono le strutture nervose più esposte e le prime ad essere colpite. Alla malattia di Parkinson è stata associata l'esposizione a pesticidi.

Per analizzare gli effetti dei pesticidi sul sistema nervoso enterico, il pesticida roone viene somministrato ai topi mediante gavaggio orale. Successivamente, i topi vengono perfusi per via intracardiaca con paraformaldeide al 4% per fissare il cervello e il sistema nervoso enterico. I tessuti vengono quindi estratti, preparati e sottoposti a immunomarcatura per le proteine associate al PD.

Le immagini di beta-tubulina tre e alfa-sinucleina ottenute mediante microscopia confocale dimostrano l'accumulo di alfa-sinucleina all'interno dei neuroni del sistema nervoso enterico negli animali esposti a pesticidi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'amministrazione sistemica di rotenone, è che con questa tecnica si garantisce che l'effetto del rotenone sia confinato al sistema nervoso enterico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla malattia di Parkinson, come la sua eziologia e i meccanismi alla base della sua progressione.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi della malattia di Parkinson, poiché permetteranno lo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e metodi diagnostici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla fisiopatologia della malattia di Parkinson, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo studio dell'effetto di altre tossine ambientali sui sistemi nervosi enterico, simpatico e parasimpatico, nonché sulla parete intestinale. In generale, le persone nuove a questi metodi incontreranno difficoltà, poiché occorre del tempo per padroneggiare la somministrazione per gavaggio.

L'idea di questi metodi mi è venuta per la prima volta quando ho letto del legame tra pesticidi e malattia di Parkinson. È stato inoltre utile partecipare alla conferenza CORAs ad alto livello tenutasi al Congresso Mondiale sul Parkinson a Berlino nel 2005. È necessaria una dimostrazione pacifica di questo metodo.

Il metodo per somministrare ol con la gavaggio è difficile poiché i topi hanno un'anatomia diversa rispetto agli esseri umani; d'altro canto, l'analisi delle immagini è stata eseguita con passaggi personalizzati per queste immagini. Iniziare il protocollo pesando l'animale. Calcolare il volume appropriato di rotenone.

Sono necessari 0,01 millilitri per grammo di peso dell'animale, corrispondenti a una dose di cinque milligrammi per chilogrammo di roone. Caricare una siringa da un millilitro con la soluzione di roone, quindi caricare una seconda siringa con la soluzione veicolare. Prendere il topo tenendo la coda del topo con una mano.

Allungare la pelle del collo tirandola con le prime due dita dell'altra mano. Una volta che la testa è fissata tra le due dita, appoggiarla sul palmo della mano e capovolgerla. Fissare la coda.

Utilizzando il quarto e il quinto dito, mantenendo la testa verso la parte posteriore, premere sul palato per aprire la bocca del topo. Introdurre delicatamente la sonda gastrica nella bocca. Spostare lentamente la sonda in direzione dello stomaco fino a quando non sarà completamente inserita.

Per evitare che il materiale entri nei polmoni, somministrare la soluzione di roone o il veicolo premendo delicatamente l'embolo. Al termine, estrarre lentamente la cannula gastrica, riposizionare l'animale in un'altra gabbia finché non sono stati trattati tutti gli animali di una stessa gabbia. Dopo il trattamento, i topi vengono perfusi per via intracardiaca con paraformaldeide al 4%.

In PBS, gli intestini vengono quindi estratti mediante dissezione e posti in saccarosio al 15% durante la notte. Il giorno successivo, il tessuto viene trasferito in saccarosio al 30% e nuovamente incubato durante la notte a quattro gradi Celsius. Il tessuto viene quindi collocato in un congelatore a meno 80 gradi Celsius e conservato fino all'uso. Utilizzando un criostato, l'intestino da 20 micron.

Le sezioni trasversali vengono trasferite su vetrini, quindi si procede con le procedure di bloccaggio e immunomarcatura. Successivamente, si utilizzano anticorpi anti beta tre tubulina e anticorpi anti alfa sinucleina. Si raccomanda che una persona esterna effettui un'analisi cieca dei dati.

Per iniziare l'analisi, aprire il software Fiji. Aprire il file dell'immagine confocale. Successivamente, separare i canali in modo da poter lavorare su ciascun canale in modo indipendente.

Chiudere i canali che non verranno utilizzati e selezionare, analizzare, impostare, scalare e regolare la dimensione del pixel a uno. Impostare la distanza nota a 0,13 e fare clic su globale. La dimensione dell'immagine verrà ora mostrata in micron.

Selezionare il canale dell'alpha sinucleina e selezionare il ganglio. Assicurarsi che la selezione racchiuda il ganglio in tutte le sezioni. Duplicare l'immagine con il ganglio selezionato; verrà duplicata solo un'immagine delle dimensioni del ganglio.

Premere modifica: la parte dell'immagine esterna alla regione selezionata diventerà nera. Duplicare nuovamente l'immagine per valutare l'efficacia della procedura. Le immagini con un rapporto segnale/rumore di fondo basso non devono essere utilizzate per l'analisi delle immagini.

Selezionare l'immagine e regolare la soglia. Quindi selezionare l'entropia massima. Successivamente, spostarsi tra le sezioni nell'immagine ritagliata e in quella originale per assicurarsi che la procedura sia andata a buon fine.

La soglia trofica seleziona un livello di segnale di intensità in base all'istogramma dell'immagine, e solo i pixel con intensità superiori a questa soglia verranno visualizzati in un'immagine bianca su sfondo nero nel processo di selezione. Quindi fare clic su "smooth" (lisciatura). Questo passaggio trasforma i bordi pixelati delle immagini in bordi lisci nel processo di selezione.

Quindi fare clic su binario e scegliere "Rendi binario". L'immagine verrà visualizzata come un'immagine in bianco e nero. Per eseguire il passaggio successivo sull'immagine duplicata, fare clic su Analizza, Analizza particelle. Selezionare quindi "Mostra contorni" e fare clic su Riassumi.

Il resto delle impostazioni deve essere lasciato ai valori predefiniti. Questa funzione riconosce il numero totale di pixel con segnale e quelli raggruppati insieme, calcolando la superficie totale dei pixel con segnale. Inoltre, vengono riportati il numero di gruppi di pixel e la dimensione media.

Confrontare e selezionare la sezione con l'area totale più ampia che si adatta bene. La sezione verrà contrassegnata. Copiare la tabella dati con la superficie totale dell'alfa-sinucleina, il numero di inclusioni e la dimensione media delle particelle.

Incollare i dati in un foglio di calcolo di Excel o annotarli altrove. Tornare a Fiji. Individuare la sezione precedentemente selezionata nel canale della beta tubulina e selezionarla.

Selezionare l'area del ganglio e fare clic su analizza. Quindi selezionare misura. Apparirà un'altra tabella che mostra la superficie totale del ganglio.

Estrai i dati dalla tabella in un foglio di calcolo Excel vicino alla misurazione dell'alfa-sinucleina oppure copiali altrove utilizzando Excel. Dividi i diversi parametri ottenuti nella misurazione dell'alfa-sinucleina per la superficie del ganglio per ottenere il valore totale della superficie dell'alfa-sinucleina e il numero di inclusioni normalizzati rispetto alla dimensione del ganglio, al fine di analizzare gli effetti di rotenone agente localmente sul sistema nervoso enterico; cinque milligrammi per chilogrammo del pesticida rotenone sono stati somministrati per via orale a topi C57BL/6 di un anno di età. Il cromatogramma mostrato qui rivela la presenza di un picco di rotenone un'ora dopo la somministrazione; controlli di topi trattati con 20 milligrammi per chilogrammo di rotenone e con 10 e cinque milligrammi per chilogrammo di rotenone.

I livelli di rotenone sono stati determinati per estratti di sangue, cervello e bulbo midollare mediante HPLC come mostrato qui. La somministrazione di cinque milligrammi per chilogrammo di rotenone per gavaggio orale non determina livelli misurabili nel sangue a un'ora, due ore o tre ore dal trattamento, come stabilito mediante HPLC. Questo grafico mostra i livelli di rotenone nel cervello e nel bulbo midollare di topi trattati.

Un'ora dopo la somministrazione di 10 milligrammi per chilogrammo o meno di rotenone, non si rilevano livelli di rotenone in campioni di cervello o bulbo midollare. Un'ora dopo la somministrazione, l'attività del complesso mitocondriale uno è stata valutata in campioni di muscolo e cervello di topi trattati per 1,5 mesi. Non vi è alcuna differenza significativa tra i gruppi, a dimostrazione dell'assenza di inibizione del complesso mitocondriale uno, confermando così l'assenza di rotenone in queste regioni.

Analisi del componente dei corpi di Lewy, l'alfa-sinucleina, nella malattia di Parkinson, dopo la somministrazione di rone, consente una determinazione affidabile della quantità totale superficiale di alfa-sinucleina, della presenza di inclusioni di alfa-sinucleina e del modello di distribuzione dell'alfa-sinucleina nella cellula. Questa figura mostra la colorazione con anticorpi anti beta-tubulina tre, alfa-sinucleina e DAPI in sezioni di duodeno e ileo, come si può osservare qui. Un trattamento di 1,5 mesi con roach noto ha indotto un aumento del modello puntiforme di alfa-sinucleina all'interno dei gangli del sistema nervoso enterico, anche rispetto ai controlli a tre mesi.

Questo schema è osservabile sia nell'ileo che nel duodeno. Dopo tre mesi di trattamento, la formazione di inclusioni più grandi di alfa-sinucleina può essere visualizzata mediante colorazione immunofluorescente utilizzando anti alfa-sinucleina, iloflavina e DPI, che dimostrano l'aggregazione di accumuli più grandi di alfa-sinucleina solo a tre mesi. L'esperimento è stato analizzato mediante metodi automatici di segmentazione e di sogliatura basati sull'entropia.

Nel grafico a sinistra, ogni colonna rappresenta il rapporto tra la superficie totale dell'alpha sinucleina e la superficie del ganglio. Nel grafico a destra, ogni colonna rappresenta il numero totale di inclusioni di alpha sinucleina per superficie del ganglio analizzata. Nel complesso, questi dati suggeriscono che l'amministrazione locale di rotenone induce la fosforilazione, l'accumulo e l'aggregazione dell'alpha sinucleina accompagnate da gliosi nei gangli del sistema nervoso enterico. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in un minuto per animale se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante introdurre la cannula per la gavaggio in modo delicato e, se si incontra un ostacolo, è preferibile rimuoverla e reinserirla seguendo nuovamente queste procedure. Possono essere eseguiti altri metodi come HPLC, colorazione immunoistochimica e analisi delle immagini. Ciò permetterà di analizzare altre regioni, gli effetti della sostanza o persino la presenza della sostanza nel sangue dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai neuroscienziati per studiare gli effetti dei neurotossici ambientali sul sistema nervoso enterico. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di applicare correttamente il gage e analizzare le immagini ottenute dall'immunochimica. Non dimenticare che lavorare con sostanze marce può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, raccomandiamo l'uso di guanti e maschere durante l'esecuzione di questa procedura. Il.