Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo mouse utilizzando

Lo scopo di questa procedura è utilizzare l'elettroporazione in utero per visualizzare e manipolare geneticamente dendriti e spine nel cervello del topo, in particolare nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo. Questo viene realizzato innanzitutto iniettando la soluzione di DNA plasmidico desiderata nel ventricolo laterale degli embrioni in utero. Successivamente, utilizzando diverse posizioni degli elettrodi Palo.

In base all'iniezione di DNA, la corteccia cerebrale o l'ippocampo vengono elettroporati, quindi in uno stadio postnatale o adulto desiderato. I topi vengono perfusi e i cervelli sono raccolti. Infine, i cervelli sono sezionati con un vibromicrotomo.

In definitiva, le dendriti e le spine possono essere visualizzate mediante microscopia confocale. La tecnica dell'elettroporazione unitaria presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi per lo studio delle dendriti e delle spine. In effetti, questa tecnica consente innanzitutto di studiare questo aspetto direttamente in vivo.

Inoltre, rispetto alla generazione di topi knockout, l'elettroporazione costituisce un approccio rapido per studiare l'effetto della soppressione genica o dell'espressione genica nel cervello e nella colonna vertebrale, non solo in specifiche strutture cellulari, ma anche in un determinato punto dello sviluppo. L'utilizzo di un sistema inducibile nell'elettroporazione intrauterina rappresenta inoltre uno strumento utile per identificare le interazioni funzionali tra geni coinvolti nello sviluppo del cervello e della colonna vertebrale. In effetti, a differenza dei virus, ad esempio, è più agevole per noi combinare più HNA o più geni bersaglio nella stessa popolazione cellulare. Per iniziare, diluire il DNA alle concentrazioni desiderate in acqua e aggiungere il colorante fast green fino a una concentrazione finale dello 0,05%. Utilizzare un micropipettatore per tirare le micropipette di vetro necessarie per l'iniezione.

Posizionare un topo gravido in una camera di induzione anestetica utilizzando isoflurano e aprire l'ossigeno fino a due litri al minuto. Quando l'animale perde il riflesso di lotta, trasferirlo su una maschera pre-operatoria. Applicare una goccia di IGEL su ciascun occhio e utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dell'addome.

Pulire l'area rasata una volta con clorhexidina per raccogliere i peli volanti. Trasferire l'animale su una seconda maschera nell'area chirurgica con il dorso sul tappetino riscaldante. Iniziare l'intervento chirurgico quando il riflesso della palpebra è stato perso.

Indossare una maschera e guanti sterili e coprire l'animale con un telo sterile. Disinfettare l'area rasata almeno tre volte con clorhexidina. Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana attraverso la cute.

Utilizzando le forbici, effettuare un'incisione simile sul muscolo dell'addome lungo il gomito lineare. Scegliere gli embrioni più accessibili.

Posizionare la pinza ad anello tra due embrioni ed estrarre con attenzione la catena embrionale dalla cavità addominale. Da questo momento in poi, mantenere gli embrioni idratati con PBS sterile preriscaldato. Utilizzando la pinza ad anello.

Manipola delicatamente la posizione dell'embrione all'interno della sacca amniotica e stabilizza la testa tra gli anelli. Premi dolcemente per spingere l'embrione più vicino alla parete uterina. Con l'altra mano, prendi il supporto della capillare e inserisci con attenzione l'ago nel centro dell'emisfero per raggiungere il ventricolo laterale.

Cercando di minimizzare il movimento dell'ago sulla superficie della parete uterina e evitando di perforare i vasi sanguigni, premere il pedale per iniettare circa 0,5 microlitri di soluzione verde di DNA. Posizionare gli elettrodi ai lati della testa dell'embrione, con il pedale positivo dallo stesso lato del ventricolo iniettato per l'elettroporazione della corteccia, oppure dal lato opposto al ventricolo iniettato per l'elettroporazione dell'ippocampo. Applicare quindi cinque impulsi elettrici di 30 volt ciascuno, della durata di 50 millisecondi, a intervalli di un secondo.

Evitare l'applicazione di corrente attraverso la placenta poiché ciò provocherebbe la morte dell'embrione. Per aumentare le probabilità di sopravvivenza, iniettare ed eseguire l'elettroporazione su tutti gli embrioni entro 30 minuti. Al termine, immergere in PBS la cavità addominale e utilizzare la pinza a anello per riposizionare il corno uterino nella sua posizione originale. Chiudere l'addome, la parete e la pelle con suture riassorbibili in vicryl. Posizionare l'animale in una camera di recupero fino al risveglio.

Successivamente trasferirlo in una gabbia su un cuscinetto riscaldante a 24 e 48 ore dopo l'intervento chirurgico. Verificare il comportamento del topo per valutare dolore, sofferenza o distress e pesare l'animale per analizzare il cervello. In stadi postnatali, utilizzare un vibratomo per sezionare i cervelli precedentemente perfusi e postfissati; montare i campioni in aqua poly mount per ottenere immagini di dendriti e spine.

Questa figura mostra esempi di cellule elettroporate nella corteccia cerebrale, nel corpo amigdaloide e nel giro dentato dell'ippocampo, mentre i topi di tipo selvaggio sono stati sottoposti a elettroporazione al giorno embrionale 14,5, momento in cui il costrutto GFP e i cervelli sono stati raccolti al quattordicesimo giorno postnatale. Iniettando un piccolo volume di soluzione di DNA, vengono marcate poche cellule, consentendo la visualizzazione dell'arborizzazione dendritica di cellule isolate positive per GFP, nonché dei loro spine a ingrandimento maggiore. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di iniettare un piccolo volume di DNA al fine di colpire solo poche cellule e poter visualizzare e quantificare gli spine o i neuroni elettrici.