Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni indotte da farmaci nelle proprietà del bicchierino lipidico, rilevate da proteine che attraversano il bicchierino. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando vescicole unilaterali grandi caricate con Fluor. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'arricchire le vescicole con gramin.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere un quencher esterno e misurare la velocità di soppressione del fluorocromo interno. Quattro. L'ultimo passaggio della procedura è quantificare la variazione nella soppressione della fluorescenza per unità di attività mediante l'adattamento di una funzione esponenziale estesa al decorso temporale della fluorescenza. In definitiva, è possibile ottenere risultati per valutare se gli amfi file possono alterare le proprietà del doppio strato lipidico.

Ciao, sono Ola Anderson. Ciao, sono Helson. Ciao, sono Richie Kapo.

E io sono Leah Sanford del laboratorio del Dottor Olaf Anderson del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica del Weill Cornell Medical College. Oggi vi mostreremo un procedimento per misurare le variazioni nelle proprietà dei bistrati lipidici. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare gli effetti di farmaci e di piccole molecole sulle proprietà dei bistrati lipidici.

Cominciamo. Nel primo giorno di questa procedura, rimuovere il lipide dal congelatore e lasciarlo equilibrare alla temperatura ambiente. Una volta raggiunto l'equilibrio, aggiungere 0,6 millilitri di una soluzione di lipide e cloroformio a 25 milligrammi per millilitro in un pallone da 25 millilitri con fondo rotondo. Successivamente, asciugare la soluzione sotto flusso di gas azoto ruotando continuamente il pallone fino a quando tutto il cloroformio sarà evaporato.

E uno strato sottile di lipidi di colore bianco ricopre tutta la metà inferiore del pallone. Lasciare asciugare ulteriormente i lipidi in un essiccatore sotto vuoto per tutta la notte. Preparare una soluzione di 100 millimolar di nitrato di sodio, 25 millimolar di A NTS e 10 millimolar di HEPs a pH 7. Quando si regola il pH di questa soluzione, evitare qualsiasi soluzione contenente cloruro.

Dato che il quenching al tallio forma un complesso insolubile con il cloruro al secondo giorno, idratare i lipidi in 1,67 millilitri di questa soluzione elettrolitica per ottenere una sospensione lipidica da 10 millimolari. Una volta raggiunta la concentrazione corretta, coprire con pellicola trasparente e vorticare accuratamente la sospensione, proteggendo il campione dalla luce con della stagnola e lasciandolo maturare a temperatura ambiente durante la notte.

Al terzo giorno, sottoporre la miscela a sonicazione per un minuto utilizzando una sonica ad bassa potenza. Successivamente, congelare e scongelare il campione per cinque minuti sul ghiaccio secco, seguiti da cinque minuti in acqua calda; ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento da quattro a cinque volte. Espellere la sospensione lipidica utilizzando un estrusore mini Avanti.

Impostare l'estrusore mini con un filtro in policarbonato da 0,1 micron e supporti per filtri, quindi estrudere la sospensione avanti e indietro per 21 volte, in modo che una sospensione quasi traslucida finisca nella siringa opposta, ottenendo una sospensione di vescicole unilamellari grandi (LUV). Rimuovere i NT esterni facendo passare la sospensione estrusa su una colonna di dialisi PD-10 precedentemente equilibrata con tampone sodico. Aggiungere 1,5 millilitri della sospensione di LUV più un millilitro di tampone sodico alla colonna.

Dopo che la soluzione è stata completamente incorporata nella colonna, eluire i liposomi con tre millilitri di tampone sodico e raccogliere l'eluito. La soluzione madre di LUV riempiti con A NTS risultante dovrebbe contenere circa quattro-cinque millimoli di lipidi e apparire traslucida. Bianco latteo.

Proteggere la soluzione dalla luce avvolgendola con della pellicola e conservarla a 13 gradi Celsius per 24 ore prima dell'uso, quindi vortexare accuratamente. La soluzione madre di LUV riempita con A NTS. Poiché le UUV hanno una densità maggiore di un grammo per millilitro e/o tendono a sedimentare.

Quindi diluire la soluzione madre di LUV riempiti con A NTS in rapporto da uno a 20 con tampone sodico. Incubare tre quarti dei liposomi con 260 nanogrammi di abidin in DMSO. Aggiungere lo stesso volume di DMSO senza gramin al quarto rimanente.

Per mantenere costante la concentrazione del solvente in tutti i campioni, lasciare che il gramin raggiunga l'equilibrio tra i monocouche interna ed esterna delle vescicole lipidiche per 24 ore a 13 gradi Celsius. In questo caso, si utilizza uno spettrofluorimetro a flusso interrotto Photophysics SX.20 dotato di controllo della temperatura per misurare la velocità di soppressione della fluorescenza. Per iniziare, accendere gli strumenti un'ora prima per consentire il tempo necessario al riscaldamento dello strumento.

La fessura con rapportatori per l'eccitazione deve essere uno a uno e un filtro passa-alto da 455 nanometri deve essere utilizzato per registrare l'emissione mediante il software Pro Data SX. Configurare innanzitutto le condizioni di registrazione, impostando le lunghezze d'onda di eccitazione del monocromatore a 352 nanometri. Utilizzare l'impostazione di mantenimento della pressione.

Impostare il tempo su un secondo e i punti su 5.000. Regolare il numero di ripetizioni a nove per le corsie con tampone e a 13 per le corsie con quencher. Monitorare la temperatura nel profilo del drive del software Essex.

Il volume di spinta deve essere impostato a 120 microlitri, il che mescola 60 microlitri da ciascuna siringa. Ciò determina un tempo morto di circa 1,2 millisecondi. Regolare la tensione alta o il guadagno sul rilevatore di fluorescenza a circa 420 volt.

L'obiettivo è ottenere una lettura di fluorescenza di circa otto. Equilibrare i UVN caricati con A NTS precedentemente preparati per 10 minuti a 25 gradi Celsius al buio. Una volta raggiunto l'equilibrio, vortexare il campione, quindi caricarlo nella siringa di sinistra. Nella siringa di destra caricare tampone sodico o tallio. Quencher.

Rimuovere eventuali bolle d'aria spingendo le siringhe avanti e indietro. Entrambe le siringhe devono essere caricate in modo uguale. Prima di chiudere le valvole per il primo campione, registrare la fluorescenza con il tampone di sodio.

Ripetere quattro volte e regolare il guadagno secondo necessità. Quindi ripetere ulteriormente cinque volte per i campioni rimanenti. Registrare nove ripetizioni con tampone al sodio.

Sostituire il tampone di sodio con l'inibitore al tallio e registrare 13 ripetizioni. Lavare con acqua e proseguire con i controlli del campione successivo. Includere campioni senza gramin e con solvente, senza gramin e con la concentrazione massima del composto.

E con entrambi il campione e il solvente che seguono il saggio di fluorescenza, acquisire i dati nel software MATLAB per l'analisi. Per ogni campione, leggere tutte le ripetizioni del tampone e dell'agenti quencher; le prime quattro ripetizioni saranno contaminate da ciò che era precedentemente presente nel tubo. In questo caso, il segnale proviene dal campione di tampone al sodio che si mescola con l'acqua del lavaggio precedente.

I ripetuti da cinque a nove rappresentano il segnale proveniente esclusivamente dal campione. Pertanto, escludiamo sempre i primi quattro ripetuti in ogni caso. Per evitare artefatti di miscelazione, esaminare manualmente i tracciati ed eliminare tutti i ripetuti difettosi, come il tracciato rosso contenente picchi o deviazioni dovuti ad artefatti di miscelazione e/o bolle.

Quindi normalizzare i ripetuti con il quencher al valore iniziale medio dei ripetuti con il tampone per ogni campione e per ogni condizione sperimentale, combinare le medie di tutti i campioni in un unico grafico; i campioni di visualizzazione senza gramine dovrebbero essere tutti simili e mostrare quasi nessun quenching della fluorescenza. Si osserva una riduzione lenta del segnale fluorescente dovuta all’ingresso lento dello ione tallio nei vescicoli per i campioni con gram sidin. Se l’andamento temporale della fluorescenza è visibilmente alterato dal composto, allora il composto modifica le proprietà del doppio strato lipidico alla concentrazione testata; successivamente, adattare un’esponenziale allungata ai primi due-trenta millisecondi delle curve di quenching della fluorescenza normalizzate.

Per le ripetizioni singole, calcolare la velocità a due millisecondi. Successivamente, calcolare le medie e le deviazioni standard per un campione specifico a partire dalle ripetizioni individuali. L'effetto della capsaicina, indicata qui come cap, è stato osservato sul corso temporale dell'estinzione della fluorescenza in assenza o in presenza di gramin, indicato come ga; il segnale fluorescente normalizzato è mostrato qui nell'arco di un secondo. I punti grigi rappresentano i risultati di tutte le ripetizioni, mentre le linee rosse indicano le medie.

I primi 100 millisecondi del segnale fluorescente normalizzato sono mostrati. I punti grigi rappresentano i risultati di un singolo ripetuto per ogni condizione. Le linee rosse sono adattamenti esponenziali allungati a tali ripetizioni.

La linea blu soffocata indica il segno dei due millisecondi. Il tempo in cui viene determinata la velocità di soppressione. La variazione relativa della velocità di soppressione è determinata normalizzando i dati rispetto al campione di controllo con gramin e senza modificatore.

Quando la capsaicina si lega al doppio strato lipidico, ne altera le proprietà. Il cambiamento verso un doppio strato più morbido si rifletterà in uno spostamento dell'equilibrio tra forma monomerica e dimerica a favore del dimero conduttivo. Vi abbiamo appena mostrato un procedimento per misurare gli effetti perturbanti di una piccola molecola sul doppio strato lipidico.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare i controlli appropriati per ogni esperimento, impiegando lo stesso lotto di vescicole. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.