Un test di screening a fluorescenza per l'identificazione di modulatori Canali GIRK
24 aprile 2012
A real-time procedura di screening per identificare i farmaci che interagiscono con la proteina G-gated verso l'interno raddrizzatore K + (GIRK) canali viene descritto. Il test utilizza coloranti fluorescenti potenziale di membrana sensibili per misurare l'attività dei canali GIRK. Questa tecnica è adattabile per l'uso su un certo numero di linee cellulari.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nuovi farmaci che modulino i canali grk. Questo viene raggiunto innanzitutto seminando le cellule A TT 20 nella piastra a 96 pozzetti. Il secondo passaggio consiste nel diluire i composti in prova utilizzando il sistema automatizzato per piastre liquide Verset.
Successivamente, i composti in prova diluiti vengono applicati alle cellule utilizzando il verset. L'ultimo passaggio consiste nell'inserire la piastra a 96 pozzetti nel lettore fluorescente per piastre Synergy due e nell'iniettare le soluzioni di controllo e di somatostatina nei pozzetti. Infine, il lettore fluorescente per piastre viene utilizzato per identificare i composti che modificano il segnale fluorescente indotto dalla somatostatina e quindi modulano i canali Grk.
Il vantaggio di questo procedimento rispetto ai metodi esistenti, come la registrazione con patch clamp, è che un elevato numero di composti può essere rapidamente analizzato per determinare se modulano i canali Gerk. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento del dolore, poiché è possibile identificare composti che attivano il canale Gerk, portando all'inibizione della trasmissione nocicettiva FI. Dimostrazione della procedura per il rivestimento. Le piastre a 96 pozzetti e la semina delle cellule è a cura di Maribel Vasquez.
Uno studente nel mio laboratorio inizia questa procedura coltivando le cellule pituitarie A TT 20 in DMEM integrato con siero equino al 10% a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5%CO2. Mantenere la coltura sottoponendo le cellule a subcoltivazione ogni cinque o sette giorni utilizzando una procedura di standardizzazione. Successivamente rivestire i pozzetti del nero trasparente.
Piastra a 96 pozzetti inferiore con 50 microlitri di poli-L-lisina. Lasciare asciugare i pozzetti per 30 minuti nell'incubatrice. Successivamente, rimuovere l'eccesso di poli-L-lisina e seminare le cellule nella piastra a 96 pozzetti contenente 200 microlitri di terreno, alla densità di 30.000 cellule per pozzetto.
Successivamente, conservare le cellule nell'incubatrice per tre o quattro giorni. Utilizzare un sistema di aspirazione per aspirare lentamente il mezzo di coltura dal monolayer cellulare, quindi lavare le cellule con 200 microlitri di soluzione tampone normale. In seguito, aggiungere 200 microlitri di soluzione tampone contenente il colorante sensibile al potenziale di membrana a ciascun campione.
Incubare bene le cellule per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 40 minuti, rimuovere le cellule A TT 20 dall'incubatore e lasciarle tornare alla temperatura ambiente, aspirare il vecchio tampone. Quindi applicare una soluzione di tampone fresca contenente il MPD alle cellule.
Successivamente, utilizzare il sistema di gestione dei liquidi per applicare diverse concentrazioni dei composti in prova e delle soluzioni di controllo alle cellule. Nella piastra a 96 pozzetti, incubare le cellule per cinque minuti con i composti in prova prima delle misurazioni fluorescenti. In questa procedura, inserire la piastra a 96 pozzetti in un lettore di piastre fluorescente Biotech Synergy Two.
Ottenere il segnale di fondo fluorescente a una lunghezza d'onda di eccitazione di 520 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 560 nanometri. Successivamente, applicare i ligandi del recettore GPCR o la soluzione di controllo nei pozzetti per attivare i canali GIR mediante il sistema di iniezione Synergy due. Quindi raccogliere i punti dati a intervalli di dieci secondi per un periodo di campionamento di 302 secondi.
Ai valori di lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione. Calcolare il fattore Z al fine di determinare l'affidabilità del saggio. Fattori Z compresi tra 0,5 e 1,0 indicano che la qualità del saggio è eccellente.
Le piastre con fattori Z inferiori a 0,5 vengono escluse. Dall'analisi, i composti che modulano il segnale fluorescente vengono sottoposti nuovamente a test in presenza di due millimoli di cloruro di bario o di 500 nanomoli di terapina Q per confermare la specificità del canale del potassio rettificatore entrante. Qui viene mostrato un segnale fluorescente rappresentativo HLB 0 2 1 1 15 2 misurato nel tempo nelle cellule A TT 20 dopo l'aggiunta di somatostatina o di soluzione controllo. Il rapporto dell'intensità fluorescente sull'asse Y è stato calcolato dividendo il segnale in presenza di somatostatina o della soluzione controllo per il segnale di base misurato prima dell'aggiunta di somatostatina o della soluzione controllo.
Qui viene mostrato il trattamento delle cellule A TT 20 con 500 nano molari. Terapina Q inibisce la riduzione mediata dal somatostatina nel segnale fluorescente legandosi ai canali due e bloccandoli. E qui viene mostrato il trattamento delle cellule A TT 20 con 20 micromolari di propafenone, che inibisce anch'esso la riduzione mediata dal somatostatina nel segnale fluorescente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente.
Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare farmaci che modulano i canali grk utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura di screening in tempo reale per l'identificazione di farmaci che interagiscono con i canali K+ rettificatori inward attivati da proteine G (GIRK). Il saggio utilizza coloranti fluorescenti sensibili al potenziale di membrana per misurare l'attività dei canali GIRK, rendendolo adattabile a diverse linee cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Farmacologia
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
Sfondo
- I canali GIRK svolgono un ruolo fondamentale nella segnalazione neuronale.
- L'identificazione di modulatori dei canali GIRK può portare a nuove strategie terapeutiche.
- La realizzazione di saggi in tempo reale migliora l'efficienza dello screening farmacologico.
- I coloranti fluorescenti forniscono una misura sensibile dell'attività del canale.
Scopo dello studio
- Sviluppare una procedura per lo screening di farmaci che modulano i canali GIRK.
- Utilizzare un formato ad alto rendimento per testare più composti.
- Migliorare la comprensione della farmacologia dei canali GIRK.
Metodi Utilizzati
- Piastreggiamento di cellule A TT 20 in una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzo del sistema di gestione liquidi Verset per diluire i composti in prova.
- Applicazione dei composti diluiti alle cellule mediante il sistema Verset.
- Utilizzo di un lettore di piastre fluorescente Synergy Two per misurare le risposte.
Risultati principali
- Identificazione di composti che modificano i segnali indotti da somatostatina.
- Dimostrazione dell'adattabilità del saggio a diverse linee cellulari.
- Modulazione efficace dell'attività dei canali GIRK da parte dei composti testati.
- Convalida dell'efficacia del lettore a piastre fluorescente nell'analisi di screening.
Conclusioni
- Il saggio sviluppato è uno strumento prezioso per la scoperta di farmaci mirati ai canali GIRK.
- Lo screening in tempo reale può accelerare l'identificazione di potenziali terapie.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni cliniche dei composti identificati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio consente l'identificazione ad alto rendimento di modulatori dei canali GIRK, supportando la validazione del bersaglio nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze e della farmacologia cardiovascolare. Fornendo letture fluorimetriche quantitative in tempo reale, riduce la dipendenza dall'elettrofisiologia a basso rendimento e accelera il passaggio da "hit" a "lead". Il metodo aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, collegando gli effetti dei composti all'attività funzionale del canale in un contesto cellulare fisiologicamente rilevante.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando la modulazione funzionale dei canali GIRK in risposta a ligandi dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR).
- Valore operativo: Consente lo screening rapido di librerie di composti per identificare attivatori o inibitori con specificità meccanicistica.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio del bersaglio confermando l'attività sul bersaglio attraverso variazioni del segnale di fluorescenza correlate all'efflusso di K+.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Utilizza coloranti sensibili al potenziale di membrana (DiBAC4(3) o HLB 021-152) per generare segnali quantificabili in tempo reale in seguito all'attivazione di GIRK.
- Riproducibilità: Il calcolo del fattore Z (intervallo eccellente: 0,5–1,0) garantisce la robustezza del saggio per la selezione dei risultati positivi e la riproducibilità delle campagne.
- Scalabilità: Compatibile con il formato a 96 pozzetti e con sistemi di manipolazione liquidi (ad esempio Verset) per la distribuzione automatizzata di composti e lo screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: I modulatori identificati potrebbero guidare strategie terapeutiche per il dolore neuropatico, le dipendenze e le aritmie cardiache attraverso l'inibizione neuronale mediata da GIRK.
- Continuità traslazionale: I segnali fluorescenti forniscono un collegamento tra l'interazione con il bersaglio e l'output funzionale, supportando l'ancoraggio del fenotipo preclinico.
- De-risking meccanicistico: La specificità viene confermata utilizzando inibitori come cloruro di bario o Terapin Q per distinguere gli effetti mediati da GIRK dall'attività fuori bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di composti promettenti, consentendo lo screening funzionale di modulatori di GIRK prima dell'ottimizzazione successiva.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando l'attivazione dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) a variazioni della fluorescenza dipendenti dai canali GIRK, chiarificando la modulazione della via di segnalazione.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso un caricamento standardizzato del colorante, l'applicazione di composti e la misurazione cinetica della fluorescenza per 300 secondi.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (rapporti di intensità della fluorescenza) che permettono il confronto tra potenza ed efficacia dei composti.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici identificando composti che modificano l'eccitabilità neuronale attraverso i canali GIRK, rilevanti nei modelli di dolore e dipendenza.
- Riutilizzo aziendale: Piattaforma adattabile a diverse linee cellulari e ligandi dei recettori GPCR, che favorisce il riutilizzo in molteplici campagne di validazione di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile della modulazione del bersaglio riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione di farmaci per canali ionici.
- Valore operativo: Offre standardizzazione, riproducibilità e dati cinetici in tempo reale non ottenibili con saggi a punto fisso.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione consentendo una validazione funzionale precoce, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dovuto alla mancata interazione con il bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione, corretta per il rischio, di composti con attività GIRK confermata per l'avanzamento verso l'ottimizzazione del capostipite.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare (cellule AT T20), nella manipolazione di coloranti fluorescenti e nell'uso di lettori a piastra cinetici.
- È dipendente da un lettore a piastra a fluorescenza dotato di funzionalità di iniezione (ad esempio, Synergy 2) e con impostazioni di eccitazione/emissione compatibili (520 nm/560 nm).
- Necessita della standardizzazione del caricamento del colorante, dei tempi di incubazione e delle condizioni del mezzo tra pozzetti e piastre.
- L'adattamento ad altre linee cellulari richiede la validazione dell'espressione dei canali GIRK e dell'efficienza di caricamento del colorante.
- Limite pratico: la specificità del saggio deve essere confermata mediante l'uso di inibitori ortogonali (ad esempio, Ba2+, Terapin Q) per escludere variazioni di fluorescenza non mediate da GIRK.
