Electroeluting frammenti di DNA

Ciao. Oggi vi mostreremo come si esegue l'elettroeluzione per purificare frammenti di DNA, come prodotti di digestione e di PCR. Per scopi successivi come il clonaggio e il sequenziamento, l'elettroeluzione può essere uno dei metodi di elezione. Sfruttando la carica elettrica negativa del DNA, viene posizionata una barriera cellulare all'interno del campo elettrico, trattenendo i frammenti e impedendone l'ulteriore migrazione.

Questo metodo consente la purificazione di un'ampia gamma di dimensioni di frammenti di DNA provenienti da diverse fonti, con un'efficienza relativamente elevata fino all'80%. Il suo basso costo rappresenta un ulteriore vantaggio della elettroeluzione rispetto ad altri metodi di purificazione, come colonne, kit a resina, tra gli altri. Il campione di DNA viene innanzitutto visualizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio colorato con bromuro di etidio, al fine di visualizzare e identificare il frammento desiderato da purificare; successivamente, deve proseguire l'elettroforesi.

Quando i frammenti sono ben separati, è possibile determinare con precisione quelli di dimensioni inferiori. Dopo l'elettroforesi, il frammento desiderato viene accuratamente escisso dal gel utilizzando una lametta nuova di zecca e avendo cura di tagliare il pezzo di gel il più vicino possibile alla banda di interesse.

Questa procedura deve essere eseguita con adeguata protezione dalla luce UV e indossando guanti. Dopo aver riempito l'elettrolizzatore con il tampone di corsa appropriato e aver cura di farlo fuoriuscire sulla superficie della piastra centrale, la fetta di gel viene posizionata all'interno di una delle ruote il più vicino possibile al canale a V. Non devono essere presenti bolle d'aria all'interno del canale a V.

Questo può essere evitato lavando il canale con tampone per rimuovere qualsiasi aria intrappolata. Successivamente, 100 microlitri della barriera ad alto contenuto salino vengono aggiunti con attenzione al canale V a partire dal sito prossimale al pozzetto. La camera viene chiusa e gli elettrodi vengono collegati alla fonte di alimentazione per iniziare l'elettrolisi a 100-120 volt.

L'intervallo di tempo dipenderà dalle dimensioni del frammento per frammenti di grandi dimensioni fino a 20 kbp. Dovrebbero essere sufficienti da 50 minuti a un'ora, mentre per frammenti piccoli è necessario effettuare un monitoraggio ogni 10 minuti con luce UV per evitare un'ulteriore eluizione attraverso la soluzione salina e nella catena del tampone finale. In questo caso, abbiamo digerito 560 nanogrammi di plasmide con gli enzimi ND uno ed entry per rilasciare un frammento di 900 basi, equivalente a 84 nanogrammi di campione.

Di conseguenza, dopo aver posizionato il frammento di gel all'interno del pozzetto, l'elettroeluzione proseguirà per 25 minuti a 100 volt. Una volta completata l'elettroeluzione e i frammenti di DNA intrappolati nel cuscinetto sud all'interno del canale in V, si recuperano 400 microlitri di soluzione dal canale, dal lato distale del contenitore, e si trasferiscono in una microprovetta da 1,5 microlitri utilizzando una punta fine applicata a una micropipetta. Procedere quindi alla precipitazione alcolica aggiungendo due volumi di etanolo assoluto freddo e mescolando mediante vortex. Inoltre, è possibile aggiungere da due a tre microlitri di glicogeno per migliorare il rendimento del recupero del DNA. Lasciare in incubazione a –20 gradi Celsius per un'ora oppure, in alternativa, conservare a questa temperatura per tutta la notte. Centrifugare a 4 gradi Celsius alla velocità massima per 25 minuti.

Questo soprannatante cardiaco e il lavaggio aggiungendo un millilitro di etanolo freddo al 70%. Centrifugare a quattro gradi Celsius alla velocità massima per cinque-dieci minuti, scartare il soprannatante e lasciare asciugare a temperatura ambiente con i tubi in posizione capovolta. Ricostituire il pellet in 10-15 microlitri di acqua priva di nucleasi ed eseguire la determinazione della concentrazione del campione. In questo caso, il campione purificato è stato risospeso in 10 microlitri di acqua e quantificato mediante spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 260 nanometri, mostrando una concentrazione di 6,3 nanogrammi per microlitro, corrispondente a un'efficienza del 75%. Potrebbe venire in mente che sarebbe meglio investire soltanto 10 minuti del proprio tempo prezioso utilizzando un kit.

Tuttavia, nonostante il tempo richiesto da questo processo, sarà possibile controllare molte delle variabili che consentono di purificare un'ampia gamma di campioni di diverse dimensioni e origini. Come si è potuto osservare nel caso presente, è stata riscontrata un'efficienza del 75%, pari o superiore a quella della maggior parte dei kit per la purificazione del DNA. Grazie per aver partecipato alla nostra sessione odierna.

Speriamo che questo protocollo si sia rivelato utile per i vostri progetti di ricerca.