Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare rapidamente la presenza di batteri specifici, come E. coli, utilizzando sonde fluogeniche di DNA Zyme innovative. In primo luogo, le sonde geniche di DNA Zyme vengono generate mediante ligazione. Successivamente, i batteri vengono coltivati per arricchire il numero di molecole bersaglio e viene preparata una miscela extracellulare accumulata a partire dal soprannatante.

La miscela extracellulare grezza viene quindi combinata con la sonda DNAzima: l'interazione tra la sonda DNAzima e le molecole bersaglio provoca il taglio della sonda, che successivamente emette fluorescenza. L'interazione tra la sonda e il bersaglio viene rilevata come un aumento della fluorescenza relativa mediante un fluorimetro. I risultati vengono quindi verificati tramite analisi elettroforetica su gel di poliacrilamide denaturante.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi basati su PCR o su anticorpi è che la procedura è più semplice e facile da eseguire. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato utilizzando il batterio modello E. coli, può essere applicato alla rilevazione di qualsiasi altro patogeno batterico trasmesso dagli alimenti o nosocomiale. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché potrebbe non essere abituato alla manipolazione di sonde di DNA sintetico e di batteri. La procedura viene dimostrata da Sergio Aguire, assistente di ricerca del mio laboratorio, e da Monso Ali, ricercatore post-dottorato, per questo protocollo.

R-F-D-E-C uno è il DNA Zyme in evidenza. È costituito dalla sequenza catalitica EC uno sottolineata in nero e dalla sequenza substrato FS uno sottolineata in verde; all'interno del substrato è presente un legame RNA indicato dalla r blu, affiancato da un DT marcato con fluoroforo indicato dalla F e da un DT marcato con quencher indicato dalla Q. RF SS uno è una versione riordinata di RFD EEC uno, in cui la sequenza catalitica EEC uno è parzialmente riorganizzata in SS uno, mentre la porzione FS uno rimane invariata. RF DEC uno e RF SS uno vengono prodotti mediante ligazione enzimatica mediata da stampo, unendo l'oligonucleotide FS uno con l'oligonucleotide EC uno o SS uno in presenza del templato di ligazione LT uno, per ottenere miscele extracellulari grezze (CEM) che saranno utilizzate come bersaglio per R-F-D-E-C uno. Iniziare dispensando due millilitri di LB in provette sterili da 14 millilitri utilizzando una pipetta elettrica.

Successivamente, utilizzando la punta sterile di una pipetta, prelevare una singola colonia di *E. coli* da una piastra agar e trasferirla in un tubo da coltura contenente LB. Porre i tubi in un incubatore regolato a 37 gradi Celsius e agitare a 250 giri al minuto per 14 ore dopo l'incubazione. Per ottenere una coltura di reinoculo al 1%, dispensare due millilitri di LB fresco in tubi da coltura da 14 millilitri e aggiungere 20 microlitri della coltura batterica ottenuta nel passaggio precedente.

Incubare i tubi a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 giri/minuto fino a quando ogni soluzione batterica raggiunge un OD a 600 di circa uno. Trasferire un millilitro di ciascun coltura in un nuovo tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri e pellettizzare le cellule mediante centrifugazione a 11.000 ×g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante limpido in un nuovo tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Conservare il surnatante a meno 20 gradi Celsius. Se non verrà utilizzato immediatamente per determinare se viene generato un segnale fluorescente dall'interazione degli enzimi del DNA con l'estratto cellulare grezzo, i campioni vengono sottoposti a saggio mediante spettrofotometria. Accendere lo spettrofotometro a fluorescenza e impostare i parametri di acquisizione dei dati con eccitazione a 488 nanometri e emissione a 520 nanometri.

Impostare inoltre lo strumento per effettuare letture ogni minuto per un'ora. Lavare tre cuvette di quarzo cristallino prima con acqua deionizzata distillata e poi con etanolo al 100%. Asciugare le cuvette soffiando gas azoto.

Etichettare le cuvette come C uno per il controllo uno, C due per il controllo due e T per il campione in esame; quindi trasferire 24 microlitri di acqua distillata e deionizzata in C uno e 24 microlitri della miscela extracellulare grezza di e coli preparata in C due e in T. Aggiungere 25 microlitri di due X RB in ciascuna cuvetta e posizionarle nel fluorimetro. Iniziare l'acquisizione dei dati di fluorescenza dopo cinque minuti, aggiungendo un microlitro di RFS S uno a cinque micromolari a C due e un microlitro di RFD eec uno a cinque micromolari a T e a C uno, assicurandosi che le letture di fluorescenza non vengano interrotte. Mescolare ciascuna soluzione mediante pipetta, quindi lasciare procedere la reazione per il tempo rimanente del periodo di acquisizione.

Salvare i dati in formato file Excel. Successivamente trasferire i dati su un computer personale e utilizzare Excel per creare un'immagine grafica. Le stesse miscele di reazione utilizzate per l'analisi mediante spettroscopia.

La fotometria può essere utilizzata per l'analisi mediante elettroforesi su gel. Dopo un'ora di acquisizione, rimuovere le cuvette dallo spettrofotometro e trasferire le soluzioni in nuovi tubi da microcentrifuga.

Interrompere le reazioni aggiungendo cinque microlitri di acetato di sodio 3 M e 125 microlitri di etanolo al 100%. Mescolare ogni soluzione mediante vortex e collocare le provette nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per un'ora dopo la centrifugazione di incubazione. Centrifugare i miscugli di reazione a 11.000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare con attenzione il soprannatante mediante pipettaggio.

Asciugare i pellet utilizzando un concentratore DNA per 10 minuti. Aggiungere 20 microlitri di buffer di carico per gel ed eseguire una breve vortex. Centrifugare brevemente con una centrifuga da banco.

Successivamente, caricare 10 microlitri dei campioni di reazione per pozzetto su un gel Dage al 10%. Rimuovere le lastre di vetro e lavarle accuratamente con acqua corrente. Per rimuovere eventuali frammenti di gel, pulire le lastre con un panno Kim.

Scansionare la piastra del gel per la fluorescenza utilizzando uno scanner Typhoon. Analizzare le immagini risultanti mediante software di quantificazione dell'immagine per valutare la sensibilità del sistema. Coltivi diluiti in serie vengono coltivati per periodi di tempo crescenti.

Per determinare il periodo minimo di incubazione necessario per rilevare un singolo batterio, preparare 10 provette da coltura contenenti due millilitri di lb, inoculare ciascuna coltura con 100 microlitri di due UFC per millilitro di una sospensione glicerolata di e coli e incubare a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 giri al minuto a 4, 8, 12, 16 e 24 ore. Raccogliere 300 microlitri da ciascuna delle provette da coltura inoculate, poiché potrebbero non esserci batteri rilevabili nei campioni raccolti ai tempi 4, 8 e 12.

Lasciare crescere la coltura rimanente per 24 ore al fine di identificare le colture contenenti batteri. Misurare l'OD 600 e precipitare le cellule mediante centrifugazione a 11.000 G per cinque minuti. Trasferire il surnatante, che contiene i CEMS, in nuove provette microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius fino all'uso il giorno successivo.

Ispezionare le colture per verificare la crescita. Solo una o due delle 10 colture potrebbero contenere *E. coli* dopo l'inoculo, mentre i tubi rimanenti non conterranno alcuna cellula. Utilizzare i CEMS ottenuti dalle colture positive nei punti temporali prestabiliti per preparare le reazioni di scissione con RFD EEC uno, analizzando le miscele di reazione mediante elettroforesi su gel DAGE come descritto in precedenza; sia la sonda RFD EEC uno che la sonda RF SS uno sono state preparate mediante legatura enzimatica delle porzioni DNAzima al substrato.

L'interazione tra FS CEM EEC e RFD EEC uno o RF SS uno è stata quindi valutata mediante spettrometria. Come si può osservare qui, R-F-D-E-C uno ha prodotto un elevato livello di segnale fluorescente dopo l'aggiunta di CEM ec.

Al contrario, R FS S uno non ha prodotto un segnale fluorescente intenso. Pertanto, la funzione di produzione della fluorescenza di RFD EEC uno. Dopo il contatto con CEM EC viene sequenziato.

Specifica per verificare che gli aumenti di fluorescenza osservati fossero dovuti al taglio del legame RNA. Le miscele di reazione sono state analizzate mediante taglio di RFD eec, uno mediante idrossido di sodio 0,25 M, che si prevede generi frammenti di RNA bifase, un frammento in cinque prime che conserva il Fluor e un frammento in tre prime che conserva l'antiquencher. Come si può vedere qui.

La miscela di reazione RFD EEC CEM EEC ha effettivamente prodotto il prodotto di scissione previsto. Inoltre, solo UNC ha scisso R-F-D-E-C e l'unico frammento a cinque primi è stato rilevabile mediante imaging a fluorescenza. Per esaminare la specificità di RFD EEC uno, sono stati eseguiti saggi di fluorescenza utilizzando CEM raccolti esclusivamente da diverse altre batteri gram-negativi e gram-positivi.

Il campione contenente CEM EC ha prodotto un aumento della fluorescenza. L'assenza di reattività incrociata con CEMS provenienti da altri batteri indica che R-F-D-E-C uno è altamente selettivo per e coli al fine di determinare il tempo minimo di coltura necessario per rilevare una singola cellula di e coli. e coli è stata diluita a una UFC per millilitro in 100 microlitri e coltivata con mezzo di crescita per 4-8, 12-16 e 24 ore. I CEMS risultanti sono stati mescolati con R-F-D-E-C uno e il taglio è stato valutato mediante dage, come mostrato qui.

Un'immagine del saggio Dage indica che R-F-D-E-C non ha prodotto il prodotto di scissione previsto. Quando reagito con CEM, l'ECS raccolto a quattro e otto ore di crescita indica che è necessario un tempo di coltura di 12 ore, una volta acquisita padronanza.

Il componente chiave di questa tecnica è che il saggio basato sull'enzima DA può essere eseguito in 60 minuti, se effettuato correttamente dopo questo sviluppo. La procedura ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'analisi biochimica per esplorare enzimi allogenici del DNA al fine di rilevare un'ampia gamma di patogeni batterici.