Determinazione del numero delle cellule durante coltura cellulare utilizzando il contatore di cellule Scettro

Il contatore di cellule Scepter è un dispositivo automatico portatile per il conteggio delle cellule, il monitoraggio del diametro e del volume cellulare e la valutazione della salute e qualità delle popolazioni cellulari. Offre significativi vantaggi rispetto ad altri metodi di conteggio, inclusi una maggiore accuratezza, facilità d'uso e un costo ridotto per il conteggio delle cellule. Utilizzando il Scepter, seguire le istruzioni visualizzate sul display grafico per aspirare le cellule nel sensore monouso.

Le cellule vengono quindi contate e il dispositivo fornisce concentrazioni cellulari e statistiche, che possono essere caricate su un computer ed analizzate. Ciao, sono Sonya. Sono una ricercatrice qui a Millport e oggi vi mostrerò come utilizzare lo scepter.

Contare le cellule è un passaggio necessario ma noioso per la coltura cellulare in vitro. Concentrazioni cellulari costanti garantiscono riproducibilità e accuratezza sperimentale. Il conteggio cellulare è importante per monitorare la vitalità e il tasso di proliferazione cellulare, valutare cellule immortali o trasformate da seminare per esperimenti successivi, trasfezione o infezione, e per la preparazione di saggi basati su cellule, nonostante la necessità di velocità e precisione.

Nel conteggio cellulare, il 71% di 400 ricercatori intervistati conta le cellule utilizzando un emocitometro. Sebbene l'emocitometria sia economica, è un processo laborioso e soggetto a bias e uso improprio da parte dell'operatore, il che porta a conteggi inaccurati. Le fonti di errore nell'emocitometria includono una distribuzione non uniforme delle cellule nel campione, un numero eccessivo o insufficiente di cellule nel campione.

Decisioni soggettive riguardo al fatto che una determinata cellula rientri nell'area definita per il conteggio. Contaminazione dell'emocitometro, variazioni tra utenti e variazioni nel tasso di riempimento dell'emocitometro per ridurre la monotonia associata al conteggio manuale. Il 29% dei ricercatori conta le cellule utilizzando dispositivi automatizzati per il conteggio cellulare.

Tuttavia, per la maggior parte dei ricercatori, il prezzo associato a questi strumenti da banco di grandi dimensioni rappresenta un ostacolo al loro utilizzo. Il contatore cellulare Scepter è un dispositivo portatile automatizzato che offre l'automazione e la precisione del conteggio coulteriano a un costo relativamente basso e in un formato portatile di facile utilizzo. Il sistema impiega il principio Coulter di rilevamento delle particelle basato sull'impedenza in un formato miniaturizzato, utilizzando una combinazione di hardware analogico e digitale per l'elaborazione del segnale di rilevamento, la memorizzazione dei dati e la visualizzazione grafica.

Il sensore monouso è progettato con una zona di rilevamento delle cellule microfabbricata che permette la discriminazione in base alla dimensione e al volume cellulare con risoluzione submicrometrica e sub-picolitro, migliorata da canali per la movimentazione precisa dei liquidi e da componenti elettronici. Il contatore cellulare Scepter visualizza graficamente le statistiche della popolazione cellulare sotto forma di istogramma da utilizzare. Il contatore cellulare Scepter inizia diluendo una sospensione monocellulare di cellule in soluzione salina tamponata al fosfato.

Una concentrazione di 10.000 a 500.000 cellule per millilitro è ottimale. Trasferire 100 microlitri di cellule diluite in un tubo microview da 1,5 millilitri. Accendere il contatore cellulare Scepter premendo e tenendo premuto l'interruttore sul retro dello strumento e attendere l'apparizione delle istruzioni a schermo.

Quando richiesto, collegare un sensore all'estremità dell'unità dello scettro con il pannello sensoriale dell'elettrodo rivolto verso la parte anteriore dello strumento. I sensori Scepter sono costituiti da una camera di campionamento modellata con precisione, dotata di una zona sensoriale elettronica e di elettrodi integrati per il rilevamento cellulare. Questi sensori permettono di discriminare la dimensione cellulare con risoluzione submicrometrica e il volume cellulare con risoluzione sub-picolitro.

Un'ingegnerizzazione costante del sensore garantisce che vengano conteggiati volumi di campione uguali e che vengano effettuate misurazioni precise delle dimensioni. Una volta collegato il sensore, eseguire ogni passaggio del processo di conteggio seguendo le istruzioni visualizzate sullo schermo come segue. Quando sullo schermo compare la scritta, tenere premuto il pistone per iniziare a premere il pistone; lo schermo indicherà quindi "immergere il sensore", immergere il sensore nella soluzione di sospensione cellulare e rilasciare il pistone per aspirare la sospensione cellulare all'interno del sensore.

Lo stantuffo agisce come un segnale elettrico e aspirerà il campione insieme al volume morto nel sensore. La velocità o l'accuratezza dell'aspirazione non sono importanti, a differenza della pipettaggio. Questo processo richiederà diversi secondi quando sarà pronto.

Lo strumento emetterà un segnale acustico e sullo schermo verrà visualizzato il campione caricato. Una volta caricato il campione nel sensore, questo viene aspirato attraverso la zona di rilevamento per valutare le dimensioni cellulari e il volume cellulare. Successivamente, attraverso i microcanali, quando vengono conteggiati 50 microlitri di campione, il sensore indica allo strumento di interrompere il conteggio.

Al termine del conteggio, lo schermo dello strumento indicherà "conteggio completato". Si prega di rimuovere il sensore e smaltirlo. Seguire il messaggio visualizzato per rimuovere e smaltire il sensore.

Lo strumento mostrerà quindi un istogramma della dimensione o del diametro delle cellule sul suo schermo, insieme alla concentrazione cellulare per millilitro. Al termine del conteggio e quando l'istogramma viene visualizzato sullo strumento, applicare le porte premendo il pulsante di attivazione, selezionare l'impostazione automatica delle porte oppure usare l'opzione precedente per impostare automaticamente la porta in base al profilo dell'istogramma o per utilizzare le porte del conteggio precedente. Indipendentemente dalla scelta effettuata, le porte possono essere spostate manualmente per un aggiustamento fine.

Regolare i dati, premere nuovamente il pulsante di attivazione per selezionare la porta sinistra e scorrere l'interruttore per spostare la porta nella posizione desiderata. Quindi premere di nuovo l'interruttore per attivare la porta destra e scorrere l'interruttore per posizionare la porta destra. Fare clic nuovamente.

Verranno visualizzate una nuova concentrazione cellulare, volume cellulare medio e diametro. L'interruttore può essere spostato su entrambi i lati per alternare la visualizzazione tra data e ora, dimensione media delle cellule e volume medio delle cellule; fino a 72 istogrammi possono essere memorizzati direttamente sullo strumento. Per caricare i dati su un computer personale, collegare lo strumento tramite la porta del cavo USB, sullo schermo del display del pc.

Fare doppio clic sull'applicazione software scepter per avviare il programma. Quindi fare clic su connetti. Tutti i conteggi verranno trasferiti automaticamente al software.

Il software di applicazione scepter visualizza l'istogramma che illustra la distribuzione della popolazione della coltura in termini di volume o diametro. I file scaricati possono quindi essere esportati in Microsoft Excel, dove i dati grezzi verranno visualizzati in classi di diametri cellulari o volumi cellulari specificati. Sono state preparate 19 diverse linee cellulari per il conteggio e le concentrazioni iniziali teoriche sono state determinate utilizzando un contatore aculter.

Queste sospensioni cellulari sono state quindi ulteriormente diluite per ottenere sospensioni cellulari con concentrazioni cellulari teoriche. Il contatore cellulare Scepter è stato quindi utilizzato per determinare le concentrazioni cellulari. Questa figura mostra cinque diluizioni misurate per cinque linee cellulari rappresentative insieme alla concentrazione cellulare teorica.

L'elevato grado di linearità, indicato dai valori di r-quadro, dimostra che il conteggio con scepter è un metodo affidabile per le linee cellulari testate su un ampio intervallo lineare di funzionamento. L'accuratezza relativa complessiva del conteggio con scepter è qui dimostrata, confrontando i dati ottenuti dal conteggio con scepter con quelli ottenuti dal conteggio con coter. Il logaritmo dei conteggi cellulari con scepter è riportato in funzione del logaritmo dei conteggi con coter e mostra che, per tutte le linee cellulari testate, i conteggi con scepter corrispondono ai conteggi con coter.

I conteggi di 19 linee cellulari sono stati effettuati utilizzando un contatore coulter Z two. Il contatore cellulare Scepter, un contatore automatizzato basato sulla visione, come il sistema di conteggio V cell o il sistema di prova count test, e i conteggi hemo TER sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore, utilizzando la stessa sospensione iniziale di cellule e diluizioni identiche. I risultati mostrati in questa figura dimostrano che le concentrazioni cellulari misurate mediante il conteggio con Scepter corrispondono strettamente alle concentrazioni cellulari teoriche con elevata linearità.

Il coefficiente percentuale di variazione o CV è stato calcolato per ogni diluizione di ciascuna linea cellulare. Per ciascun sistema di conta qui mostrato, sono riportati i valori medi dei CV percentuali su 19 linee cellulari in relazione alla concentrazione cellulare e al metodo di conta all'interno del range operativo. Il contatore cellulare Scepter è più preciso della conta con emocitometro, mostrando deviazioni standard minori e coefficienti di variazione medi più bassi.

Il conteggio con Scepter è 10 volte più veloce della citometria ematica e più rapido anche rispetto ad altri contatori automatici. Qui le cellule SF nine, MCF seven e HC 2 93 sono state contate utilizzando i metodi descritti in questo video. È stato registrato il tempo medio necessario per misurare la concentrazione cellulare.

Si noti che la citometria ematica è stata eseguita una sola volta per ogni campione. Scepter effettua misurazioni in base alla dimensione cellulare. Pertanto, eventuali modifiche nella morfologia cellulare possono essere rilevate nell'istogramma.

Le colture sane mostrano una bella distribuzione gaussiana a forma di campana, mentre le cellule non vitali muoiono e causano uno spostamento dell'istogramma verso sinistra. Analogamente, quando una popolazione composta al 50% da cellule morte è stata mescolata con il 50% di cellule vive, sono stati osservati spostamenti nell'istogramma. Vi ho appena mostrato come utilizzare il nuovo contatore cellulare Scepter di Millipore, che sta rivoluzionando il modo in cui i ricercatori contano le proprie cellule.