Conteggio cellule staminali neuronali
22 agosto 2007
Conoscenza del numero esatto di cellule vitali è necessaria per manipolazioni molte colture di tessuti. Questo protocollo descrive come distinguere tra cellule vive e morte e quantificare le cellule utilizzando un emocitometro. Anche se descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), può essere utilizzato per altri tipi di cellule.
Ora vi mostrerò come contare le cellule precursori neurali umane. Si contano le cellule quando si desidera utilizzarle per l'immunochimica o quando si intende eseguire una trasfezione con il macchinario del fattore nucleare. Utilizzo un emocitometro a contrasto di fase dotato di una griglia perimetrale e impiego anche un colorante chiamato trip blue. Questo colorante è utile perché permette di distinguere tra cellule vive e morte.
Le cellule morte o morenti assorbono questo colorante e appaiono blu. Quando si osservano le cellule al citometro ematico, le cellule vive sono in grado di escludere questo colorante e, quindi, non appaiono blu. In questo modo è possibile determinare la vitalità delle proprie cellule per preparare una soluzione di trip, blu e mezzo di coltura.
Aggiungerò 20 microlitri di soluzione di trappola e blu in questa provetta eppendorf da 0,5 ml. Successivamente aggiungerò 25 microlitri di mezzo. In questo modo, al momento avrò 45 microlitri di una soluzione di trappola, blu di pan e mezzo, in modo che quando aggiungerò 5 microlitri di sospensione cellulare, otterrò una diluizione 1:10.
E ora aggiungerò cinque microlitri di sospensione cellulare. Per prima cosa, verificherò che le cellule siano ben risospese mediante vortexaggio con le dita. Ora voglio assicurarmi che questa soluzione sia ben mescolata.
Quindi alzerò e abbasserò il letto alcune volte. Infine, caricherò circa 12 microlitri di questa sospensione cellulare in un emocitometro. Ne ha due porte e si può utilizzare indifferentemente l'una o l'altra.
Quindi tutto ciò che devi fare è introdurre la soluzione in questo orifizio e il liquido verrà aspirato per azione capillare. Ora sono pronto per effettuare il conteggio. Ecco un'immagine del citometro per emazie a 10 x; qui abbiamo un quadrante che contiene 16 quadratini.
E come potete vedere, possiamo osservare qui cellule vive e morte. Qui abbiamo cellule vive come questa, questa e questa. E abbiamo anche alcune cellule morte, come questa.
Se si osserva, la cellula morta appare di un blu scuro, mentre le cellule vive presentano una sorta di alone intorno a loro. Ora procederò a contare tutte le cellule vive. Perciò andrò da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Quindi abbiamo un totale di trentasei cellule in questo quadrante. Quando osservo cellule che si trovano sul confine del quadrante, come lungo questa linea qui, per essere coerente, conto le cellule che si trovano sul bordo sinistro e sul bordo superiore.
E conto in modo costante le cellule lungo questi bordi per tutti i quadranti dell'emo-citometro. Ora procederemo a calcolare quante cellule sono presenti per microlitro. A tale scopo, prenderò la media delle cellule per quadrante, che è 38, e la moltiplicherò per 10, un fattore determinato dalle dimensioni della camera.
E moltiplicheremo anche per 10, che è il nostro fattore di diluizione in questo caso. E alla fine otterremo il numero di cellule per microlitro. Quindi, in questo caso, abbiamo 3.800 cellule per microlitro.
E poiché abbiamo risospeso il nostro pellet cellulare in 500 microlitri di soluzione, è possibile calcolare il numero totale di cellule. E siamo pronti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per il conteggio di cellule staminali/precursori neurali umane (hNSPCs) mediante l'utilizzo di un emocitometro. Si sottolinea l'importanza di distinguere tra cellule vive e morte per diverse applicazioni in coltura tissutale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Cultura tissutale
Sfondo
- Il conteggio delle cellule vitali è fondamentale per le manipolazioni della coltura tessutale.
- Le cellule vive possono escludere certi coloranti, mentre le cellule morte non possono.
- Il emocitometro è uno strumento standard per il conteggio cellulare.
- Il colorante blu di tripano è comunemente usato per valutare la vitalità cellulare.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per il conteggio degli hNSPC.
- Differenziare efficacemente cellule vive e morte.
- Aiutare i ricercatori nella preparazione per esperimenti successivi come immunocitochimica o trasfezione.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un emocitometro a contrasto di fase.
- Applicazione del colorante Trippan blu per distinguere la vitalità cellulare.
- Conteggio delle cellule al microscopio.
- Preparazione di una soluzione di Trippan blu e mezzo di coltura.
Risultati principali
- Corretta differenziazione tra cellule vive e morte.
- Quantificazione accurata degli hNSPC.
- Dimostrazione dell'efficacia del colorante Trippan blue.
- Convalida dell'emocitometro come metodo affidabile per il conteggio cellulare.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio semplice per il conteggio cellulare.
- È applicabile a diversi tipi cellulari oltre agli hNSPCs.
- Comprendere la vitalità cellulare è essenziale per esperimenti di coltura tessutale riusciti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione accurata di cellule staminali/precursori neurali umane vitali (hNSPCs) è essenziale per flussi di lavoro riproducibili di coltura tessutale nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Questo protocollo consente una valutazione affidabile della vitalità cellulare e la misurazione della concentrazione, supportando un'allestimento sperimentale costante per applicazioni successive come l'immunocitochimica e la trasfezione. Standardizzando la discriminazione tra cellule vive e morte mediante l'uso del blu di tripano e il conteggio basato su ematocitometro, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei processi di validazione precoce del bersaglio e nello sviluppo di saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette un'impianatura precisa di hNSPC per studi sull'interazione con bersagli e sulla modulazione di vie di segnalazione.
- Valore operativo: Riduce la variabilità nei saggi cellulari garantendo un apporto costante di cellule vitali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce dati quantitativi e riproducibili sulla concentrazione cellulare, fondamentali per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Consente la preparazione scalabile di sospensioni cellulari per formati di screening ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la coerenza dell'input cellulare attraverso le fasi di transizione dalla scoperta alla preclinica.
- Valore operativo: Favorisce la collaborazione interfunzionale attraverso pratiche standardizzate di conteggio cellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando una preparazione affidabile delle cellule dalla validazione dell'obiettivo fino all'ottimizzazione dei saggi e ai test preclinici di efficacia.
- Biologia della scoperta: Garantisce un dosaggio cellulare accurato per esperimenti di validazione dell'obiettivo che coinvolgono hNSPCs.
- Screening: Fornisce input cellulari standardizzati e quantificabili necessari per prestazioni riproducibili dei saggi.
- Analisi: Genera valori di concentrazione cellulare vitale e conteggio totale utilizzati per normalizzare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità nella manipolazione cellulare tra la scoperta in vitro e i modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità trasferibile e a bassa complessità applicabile a diversi tipi cellulari e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva riducendo al minimo la variabilità negli input sperimentali basati su cellule.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori e team.
- Valore strategico: Favorisce decisioni più solide di avanzamento o interruzione grazie a basi sperimentali affidabili.
- Impatto sul portafoglio: Consente un avanzamento proporzionato ai rischi assicurando la qualità dei dati nella valutazione precoce dell'efficacia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nelle tecniche di coltura cellulare e nella microscopia.
- Dipende dalla disponibilità di un emocitometro e da una corretta pulizia per evitare contaminazioni.
- Necessita di una formazione costante dell'operatore per garantire una selezione imparziale dei quadranti e l'applicazione corretta delle regole di conteggio ai bordi.
- Limitato dalla capacità di conteggio manuale; non adatto all'automazione ad alto rendimento senza adattamenti.
- Si basa su una diluizione e un mescolamento corretti per assicurare un campionamento rappresentativo della sospensione cellulare.
