Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire una configurazione rapida e affidabile, automatizzata, di array basati su QPCR. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando i set di primer per l'array e allestendo i mix master dei campioni da analizzare. Successivamente, si utilizza un sistema automatizzato robotico per l’allestimento della PCR oppure un sistema di pipette elettroniche a matrice per distribuire con precisione il mix master del campione e i set di primer in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.

Dopo aver preparato le reazioni PCR in piastre a 384 pozzetti, queste vengono eseguite utilizzando il programma PCR basato sul Light Cycler Four 80 Cyber. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analizzare i dati di QPCR e determinare i livelli di espressione relativi per ciascuna coppia di primer testata, ognuna delle quali mira a un mRNA specifico. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni nell'espressione di ampi insiemi di mRNA.

Array specifici sviluppati appositamente possono quindi mirare a interi profili di microRNA precursore, a percorsi specifici o a molecole chiave nell'infezione virale mediante profilazione basata su QPCR. Salve, sono Dirk DMA del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università del North Carolina a Chapel Hill. Oggi vi mostreremo come impostare una QQPC rra in tempo reale e vi illustreremo due metodi.

Uno utilizza una pipetta irregolare e l'altro un robot. Utilizziamo questa tecnologia per misurare i pre-microRNA e i microRNA maturi nei tumori umani. La dimostrazione di oggi sarà effettuata da Pauline Chu e Kristen bu.

Iniziamo. Per iniziare questa procedura, recuperare le piastre con primer contenenti 186 coppie di primer in un formato a 96 pozzetti a 0,5 picoMoli, conservate a meno 20 gradi Celsius.

Dopo aver scongelato le piastre a temperatura ambiente, vortexarle e centrifugarle brevemente. Scongelare anche il mix PCR con cyber green a temperatura ambiente. Per l'allestimento di ciascuna piastra di primer a 96 pozzetti, saranno necessarie quattro provette con mix master. Preparare il mix master combinando quattro microlitri di mix con cyber green, tre microlitri di acqua per PCR e da 10 a 20 nanogrammi di DNA o cDNA campione per reazione in ciascuna delle quattro provette Eppendorf da due millilitri.

Ogni tubo deve contenere una quantità sufficiente di mix master per circa 100 reazioni, prevedendo un eccesso per compensare gli scarti durante la pipettaggio. Vortexare i tubi einor per mescolare. Iniziare l'allestimento del saggio per micro RNA precursore utilizzando il robot Tecan EVO Freedom, inizializzando il robot e caricando il programma EVO wear.

Quindi, sciacquare il robot tre volte con 30 millilitri di liquido di sistema per eliminare le bolle d'aria che potrebbero interferire con la precisione della pipettaggio. Successivamente, configurare la piattaforma robotica includendo una piastra da 384 pozzetti e una piastra di primer da 96 pozzetti. Il mix master, un serbatoio contenente ipoclorito al 2%, un contenitore di liquido pieno e un contenitore di rifiuti vuoto.

Avviare l'esecuzione automatizzata del robot selezionando due volte "esegui" alla fine del programma. Rimuovere la piastra a 384 pozzetti e sigillarla con pellicola per LightCycler da 80 pozzetti. Successivamente, centrifugare la piastra.

Posizionare brevemente la piastra sigillata a 384 pozzetti nella posizione uno dell'hotel. Ripetere quindi questo processo per la piastra primer due con nuove miscele master e una nuova piastra a 384 pozzetti. Posizionare la piastra a 384 pozzetti risultante, sigillata, nella posizione due dell'hotel.

Aprire un nuovo programma EVO wear per il caricamento del ciclatore termico dall'hotel e impostare i parametri di ciclaggio. Quindi selezionare esegui due volte. Freedom Evo caricherà automaticamente ogni piastra nel ciclatore termico ed eseguirà il programma di ciclaggio HRM con cyber green.

Una volta completato, esaminare e analizzare i risultati come descritto nel protocollo scritto, come alternativa all'uso del robot. Una pipetta elettronica multicanale a matrice può essere utilizzata per iniziare a trasferire il contenuto del tubo della miscela madre in un serbatoio.

Impostare la pipetta elettronica per aspirare 16 microlitri di master mix con due erogazioni successive da otto microlitri seguite da un passaggio di spurgo. Dopo aver impostato la pipetta, aspirare 16 microlitri di master mix e iniziare a dispensarli in una piastra a ruota da 384 pozzetti. Erogare i primi otto microlitri in ogni altra riga della colonna uno, utilizzando le righe da A a O, lasciando la colonna successiva vuota.

Dispensare i successivi otto microlitri nelle stesse righe della colonna tre. Quindi eseguire la purga sopra un contenitore di rifiuti e smaltire le punte seguendo questo schema, lasciando righe e colonne alternate. Dispensare lungo la piastra per altri cinque cicli per pipettare il master mix due.

Utilizzare le stesse righe del master mix uno, ma iniziare dalla colonna due. Ripetere questa procedura per i master mix tre e quattro, iniziando rispettivamente dalle colonne uno e due, ma questa volta utilizzando la rosa B per la citazione del primer plate da parte di P.Her. Impostare una pipetta elettronica per aspirare due microlitri ed erogare due microlitri con un passaggio di spurgo da eseguire successivamente.

Trasferire due microlitri di primer dalla colonna uno, riga A ad H, di una piastra primer a 96 pozzetti a ogni altra colonna dispari della piastra a 384 pozzetti, scaricando sopra un contenitore di rifiuti e smaltendo le punte. Ripetere questo schema per il quarto primer per le tre miscele master rimanenti delle colonne uno e due. Proseguire quindi con questo processo per le colonne da due a dodici della piastra primer a 96 pozzetti, spostandosi ogni due colonne nella piastra a 384 pozzetti per ogni colonna di primer.

Successivamente, sigillare le piastre con un coperchio per light cycler, della pellicola di alluminio e centrifugare. Dopo una breve centrifugazione, posizionare le piastre in un light cycler four 80 ed eseguire i cicli utilizzando il formato di rilevamento HRM con cyber green one.

Utilizzando le stesse condizioni di ciclaggio di prima, ripetere questa procedura utilizzando la piastra di primer due Eloqua in una nuova piastra da 384 pozzetti, impiegando miscele master appena preparate. Le firme di micro RNA precursori emergono tramite profilazione mediante un array basato su QPCR innovativo. Il delta CT medio, normalizzato rispetto a U sei, è stato calcolato e i valori standardizzati sono stati caricati nell'array.

Software minore che produce tre cluster distinti visualizzati come mappe termiche. L'espressione relativa di ciascun micro RNA precursore è mostrata; il rosso e il blu rappresentano rispettivamente un aumento e una diminuzione dell'espressione relativa. L'intensità del colore indica il grado di variazione dell'espressione.

La maggior parte dei microRNA precursori ha subito piccole variazioni non significative, come previsto. Tuttavia, una piccola porzione di microRNA precursori è aumentata significativamente nel corso dell'esperimento temporale. Inoltre, il livello relativo di alcuni microRNA precursori è diminuito in modo drammatico.

In alcuni casi, si raggruppano anche insieme nell'analisi della mappa termica. A seconda dell'esperimento, possono emergere gruppi legati all'infezione virale, all'espressione specifica del tipo cellulare di microRNA precursori o a microRNA precursori regolati da una molecola comune o da un percorso di segnalazione.

I valori medi delle soglie di ciclo o ct di un campione negativo per il virus dell'herpes associato al sarcoma di Posey, analizzato in quadruplicato, sono mostrati. È importante notare che l'antigene nucleare associato alla latenza del virus dell'herpes umano 8, o KSHV Lana, non è stato rilevato in questo campione mediante l'array QPCR altamente sensibile. Tuttavia, sia il controllo interno U sei che let sette a, un microRNA umano precursore altamente espresso, erano espressi a livelli rilevabili.

Infine, come previsto, il controllo negativo con acqua di grado PCR non ha prodotto alcun prodotto A-Q-P-C-R. Analisi della curva di denaturazione per due primer diversi, utilizzando lo stesso duplicato di campionamento, è mostrata.

È chiaro che la temperatura di fusione è diversa per le due coppie di primer, ma il campione fonde esattamente alla stessa temperatura in ogni replicato. Segni di un campione difettoso o potenzialmente contaminato possono includere diversi picchi di fusione, che suggeriscono la presenza di due diverse fonti di materiale in ingresso. Vi abbiamo appena mostrato come impostare un esperimento di QPCR in tempo reale utilizzando un robot.

È importante che tu includa tutti i controlli e il maggior numero possibile di geni di controllo. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.