Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA
28 ottobre 2011
Una semplice procedura di eseguire esperimenti microarray su ordinazione microRNA è descritto. I passaggi includono isolare RNA, l'etichettatura RNA e DNA di riferimento, ibridando i campioni di microarray, la scansione del microarray, quantificare e analizzare segnali di ibridazione.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un esperimento di microarray per microRNA. Questo viene realizzato innanzitutto acquisendo delle lamelle di microarray stampate che contengono una libreria di sonde per microRNA e preparando campioni di RNA di qualità e quantità adeguate. Successivamente, l'RNA e un campione di DNA controllato vengono marcati con coloranti fluorescenti.
Successivamente, gli acidi nucleici marcati vengono aggiunti a una lamella per microarray per l'ibridazione. Infine, la lamella per microarray viene lavata e scansionata, e quindi rigenerata. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'espressione genomica su scala globale dei microRNA attraverso l'analisi della lamella per le intensità di ibridazione delle singole sonde di microRNA.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'espressione genica, ad esempio come condizioni fisiologiche normali o condizioni patologiche influenzino in modo differenziale le esigenze di espressione micro a livello globale. La qualità della fabbricazione del microarray è uno dei fattori più critici per il successo di un esperimento con microarray. Dopo aver isolato l'RNA utilizzando un metodo che preserva gli RNA piccoli e averlo risospeso a una concentrazione pari o superiore a due milligrammi per millilitro, etichettare l'RNA in un volume di reazione di 20 microlitri mescolando innanzitutto circa 25 microgrammi di RNA totale con 0,5 microgrammi di cinque prime P-C-U-D-Y 5 4 7 3 prime in un X HEPs buffer integrato con T four RNA Ligase 1D TT e ATP. Se è disponibile meno RNA, ridurre proporzionalmente la quantità di RNA e il volume della reazione.
Se l'RNA è molto diluito, aggiungere un vettore come lievito o TRNA per favorire la precipitazione; incubare la reazione sul ghiaccio all'interno di un refrigeratore per due-24 ore. Successivamente, aggiungere acetato di sodio fino a una concentrazione di 0,3 molare e poi tre volumi di etanolo, quindi precipitare l'RNA per tutta la notte a -20 gradi Celsius. Per utilizzare i vetrini per la prima volta, pre-ibridizzarli in una soluzione filtrata di 3 XSSC, 0,1% SDS e 0,2% BSA per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius.
Successivamente, immergere i vetrini nell'acqua diverse volte. Quindi, in isopropanolo, asciugare i vetrini utilizzando una centrifuga con adattatore per vetrini a 100 ×g per cinque minuti a 22 °C. Sciacquare le strisce sollevatrici in acqua.
Quindi in etanolo prima di essiccare all'aria, posizionare un vetrino all'interno della base di una camera per ibridazione microarray e un lifter slip sopra il vetrino in modo che il lifter slip copra l'area della sonda e le sue strisce bianche. Tenere il vetrino al buio, centrifugare l'RNA marcato precipitato, lavarlo una volta con etanolo al 70% ed essiccare il pellet all'aria. Il pellet dovrebbe avere un colore rossastro.
Preparare una soluzione di ibridazione utilizzando da un quindicesimo a un centesimo in volume del DNA di riferimento marcato purificato per ogni campione di RNA. Sciogliere completamente il pellet di RNA con circa 60 microlitri della soluzione di ibridazione per assicurare che la soluzione non si secchi. Durante l'incubazione, aggiungere 20 microlitri di acqua in ciascuna delle pozzette umidificanti. Nella base della camera di ibridazione per microarray.
Aggiungere la miscela di RNA marcato e DNA di riferimento al vetrino. Utilizzando una punta di pipetta sottile, toccare delicatamente il bordo del coprioggetto sollevatore e, mediante capillarità, permettere alla soluzione di penetrare nello spazio tra il coprioggetto sollevatore e il vetrino.
Posizionare il coperchio della camera di ibridazione sulla base. Quindi sigillare la camera con clip metalliche. Inserire l'intera camera all'interno del sacchetto di plastica fornito con la cassetta della camera.
Infine, posizionare la cassetta della camera all'interno di un contenitore con un tovagliolo di carta bagnato. Quindi coprire il contenitore con pellicola trasparente e collocarlo all'interno di un'incubatrice per colture cellulari umida a 37 gradi Celsius per circa 24 ore. Per processare i vetrini dopo l'ibridazione, smontare le cassette della camera una alla volta, immergere un vetrino e la sua slitta di sollevamento in due XSSC a 22 gradi Celsius.
Il lifter slip cadrà naturalmente dal vetrino; lavare i vetrini due volte in 0,8 XSSC, quindi tre volte in 0,4 XSSC per un tempo totale di uno-due minuti. Asciugare i vetrini utilizzando una centrifuga con adattatore per vetrini. Successivamente, scansionare i vetrini con uno scanner per microarray e utilizzare un programma come blue fuse per quantificare le intensità nei file di immagine.
Ispezionare singoli spot per escludere spot anomali che solitamente derivano dalla stampa della piastra con pori o dalla manipolazione della piastra dopo l'ibridazione. Per l'analisi e la presentazione dei dati, utilizzare programmi come Gene Spring ed Excel per riutilizzare il microarray. Svuotare la piastra risciacquandola in acqua, quindi immergendola in una vaschetta di colorazione contenente NaOH 1 millimolare pre-riscaldata e 0,1 XSSC a 62 gradi Celsius per 10-20 minuti.
Ripetere l'incubazione una seconda volta. Lavare i vetrini più volte in acqua per un massimo di 60 minuti con agitazione delicata a 22 gradi Celsius. Asciugare i vetrini utilizzando una centrifuga e conservarli a 22 gradi Celsius.
Le diapositive possono essere utilizzate senza pre-ibridazione. Questa figura mostra un'immagine scannerizzata di un microarray che evidenzia segnali di ibridazione molto precisi e intensi. I punti rossi derivano dall'ibridazione del DNA di riferimento, i punti verdi dal campione di RNA marcato con DY 5 47, mentre i punti gialli sono il risultato dell'ibridazione sia del DNA che dell'RNA con le stesse sonde.
I coefficienti di correlazione di Pearson tra replicati tecnici dell'ibridazione con microarray sono circa 0,99, indicando un'eccellente riproducibilità. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento personalizzato con microarray, non solo per quantificare il micronase, ma anche per quantificare altri tipi di acidi nucleici come gli mRNA.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura per eseguire esperimenti personalizzati con microarray di microRNA. Il processo prevede l'isolamento dell'RNA, la sua etichettatura insieme al DNA di riferimento, l'ibridazione dei campioni su microarray e l'analisi dei segnali di ibridazione risultanti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca sui microRNA
- Analisi dell'espressione genomica
Sfondo
- Le microarray sono strumenti essenziali per lo studio dell'espressione genica.
- I microRNA svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dell'espressione genica.
- Comprendere i profili dei microRNA può fornire informazioni su diversi processi biologici.
Scopo dello studio
- Per eseguire efficacemente esperimenti di microarray per microRNA.
- Per analizzare l'espressione genomica su larga scala dei microRNA.
Metodi Utilizzati
- Acquisizione di vetrini per microarray stampati con sonde per microRNA.
- Preparazione di campioni di RNA con qualità e quantità adeguate.
- Etichettatura di RNA e campioni di DNA controllati con coloranti fluorescenti.
- Ibridazione di acidi nucleici etichettati su vetrini per microarray.
Risultati principali
- Ibridazione riuscita dei campioni con microarray.
- Quantificazione dei segnali di ibridazione per valutare l'espressione dei microRNA.
Conclusioni
- La procedura consente un'analisi completa dell'espressione dei microRNA.
- I risultati possono orientare ulteriori ricerche sulla regolazione genica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli esperimenti personalizzati con microarray per miRNA consentono il profiling ad alto rendimento dell'espressione dei microRNA, supportando la validazione dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. Il metodo fornisce dati quantitativi e riproducibili che orientano le decisioni di proseguimento o interruzione del progetto e riducono il rischio biologico nella verifica di ipotesi terapeutiche. È applicabile in diversi ambiti patologici in cui è implicata una disregolazione dei miRNA, come l'oncologia e le fibrosi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il profilo delle variazioni dell'espressione di miRNA a livello genomica in condizioni fisiologiche o patologiche.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la quantificazione riproducibile di bersagli di miRNA mediante etichettatura fluorescente e ibridazione.
- Valore predittivo: Genera dati di espressione che aiutano a prioritizzare bersagli con elevata rilevanza per la malattia e potenziale regolatorio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce vetrini per microarray standardizzati con set di sonde validate per un rilevamento consistente dei miRNA tra diversi esperimenti.
- Output quantitativo: Fornisce misurazioni dell'intensità dei singoli spot che permettono l'analisi comparativa dei livelli di espressione dei miRNA.
- Scalabilità: Consente la rimozione e la rigenerazione dei vetrini per ridurre i costi e migliorare la coerenza nelle campagne di screening su larga scala.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i profili di miRNA nella fase di scoperta alla validazione preclinica identificando modelli di espressione associati alla malattia.
- Allineamento del Biomarcatore: Favorisce l'identificazione di miRNA con potenziale prognostico o diagnostico nei modelli di malattia.
- Avanzamento Aggiustato per il Rischio: Fornisce dati sull'espressione che guidano la selezione dei bersagli e le strategie di modulazione dei percorsi nella fase di identificazione del capostazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del capostipite, consentendo un filtraggio dei candidati basato sull'espressione prima dell'investimento preclinico.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi rivelando come condizioni normali o patologiche influenzino l'espressione globale dei miRNA.
- Screening: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso protocolli standardizzati di ibridazione, lavaggio e scansione.
- Analisi: Genera intensità di ibridazione quantificabili che permettono confronti statistici tra diverse condizioni e ripetizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i cambiamenti nell'espressione dei miRNA ai meccanismi delle malattie, supportando studi preclinici basati su biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo di acidi nucleici oltre i miRNA, inclusi gli mRNA, con minime modifiche al protocollo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità nella regolazione genica mediata da miRNA.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso flussi di lavoro standardizzati per etichettatura, ibridazione e quantificazione del segnale.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo schermature ad alto rendimento ed economiche dei profili di espressione dei miRNA.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio degli obiettivi sulla base di dati robusti ed espressione su scala genomica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di isolamento dell'RNA che preservano le specie di RNA di piccole dimensioni e nei protocolli di marcatura fluorescente.
- Presuppone l'accesso a scanner per microarray e software di analisi delle immagini come BlueFuse o GeneSpring per la quantificazione del segnale.
- Necessita della standardizzazione delle condizioni di ibridazione, dei tamponi di lavaggio e della manipolazione delle vetrine tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la coerenza dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il metodo ad altri tipi di acidi nucleici, come gli mRNA, richiedendo aggiustamenti nel set di sonde e nella marcatura.
- Comprende limitazioni pratiche legate alla qualità delle vetrine, all'efficienza di ibridazione e alla necessità di replicati tecnici per ottenere coefficienti di correlazione di Pearson affidabili (>0,99).
