Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare gli intermedi strutturali del DNA che si formano quando la replicazione incontra lesioni del DNA, mediante analisi elettroforetica su gel bidimensionale. Questo risultato si ottiene isolando innanzitutto il DNA da cellule in attiva divisione in cui sono state indotte lesioni bloccanti la replicazione. Successivamente, l'elettroforesi su gel viene utilizzata per separare il DNA recuperato in base alle dimensioni.

Successivamente, le corsie vengono ritagliate e ricollocate orizzontalmente in un secondo gel che separa ulteriormente il DNA in base a dimensione e forma. Infine, l'analisi southern viene utilizzata per visualizzare le strutture del DNA associate ai frammenti di DNA in replicazione in momenti precedenti e successivi all'introduzione di danni indotti da raggi UV. In definitiva, questa procedura può dimostrare che l'incapacità di elaborare lesioni del DNA in determinati mutanti porta all'accumulo di intermedi della riparazione del DNA.

Ciao, mi chiamo Arthur Ian. Provengo dal laboratorio Corella della Portland State University. Ciao, mi chiamo Brand she, anch'io provengo dal laboratorio Corella.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'elettroforesi in gel bidimensionale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare gli intermedi della replicazione e della riparazione del DNA. Cominciamo dunque.

Per iniziare questa procedura, coltivare una cultura notturna di 200 microlitri di e coli contenente il plasmide PBR 3 22 in mezzo DGC thigh con ampicillina a 37 gradi Celsius. L'uso del mezzo DGC thigh minimizza la schermatura UV. Dopo l'incubazione notturna, centrifugare le cellule a 14.000 RRP M per 30 secondi.

Sospendere quindi il pellet cellulare in 200 microlitri di mezzo DG C th privo di ampicillina e inoculare. Coltivare 20 millilitri di mezzo DG C thigh senza selezione con ampicillina in un incubatore sotto agitazione a 37 gradi Celsius fino a un OD 600 di 0,5, che corrisponde a circa cinque per 10 alla ottava cellule per millilitro. La crescita senza ampicillina evita la selezione contro intermediari di replicazione anomali o non produttivi che potrebbero formarsi in alcuni mutanti.

Inoltre, se si utilizza la luce UV per indurre danni, è necessario rimuovere l'ampicillina dal mezzo poiché assorbe fortemente a queste lunghezze d'onda e scherma le cellule, riducendo così la dose efficace di UV durante la crescita cellulare. Utilizzare un fotometro UVC per determinare la distanza da una lampada germicida da 15 watt che produca una velocità di esposizione di circa un JUUL per metro quadrato al secondo.

I passaggi successivi devono essere eseguiti sotto luce gialla, poiché ciò impedirà la reversione fotoindotta dei dimeri di ciclobutano pirimidinici mediata dalla fotoliasi dopo l'irradiazione UV. Una volta raggiunta la densità cellulare desiderata, utilizzare una pipetta per trasferire la coltura in una piastra di Petri di diametro 15 centimetri posta su una piattaforma rotante, al fine di garantire un'irradiazione uniforme dell'intera popolazione cellulare. Successivamente, irradiare le colture con 50 joule per metro quadrato e trasferirle immediatamente in un flacone sterile preriscaldato, quindi riposizionarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius con agitazione.

Per tutta la durata dell'esperimento, questa dose produce in media un dimero ciclobutano perinico ogni 4,5 chilobasi di DNA a filamento singolo per ciascun punto temporale da esaminare. Pipettare un'aliquote di 0,75 millilitri della coltura in 0,75 millilitri di buffer NET 30 freddo di ghiaccio. Il buffer NET 30 funge da buffer di arresto che impedisce il proseguimento della replicazione e della riparazione mediante escissione di nucleotidi.

Dopo l'aggiunta del buffer di arresto, il campione può essere mantenuto sul ghiaccio fino al termine del corso temporale. Al termine del corso temporale, centrifugare ogni campione e risospendere i pellet. In 150 microlitri di buffer di lisi, lisare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti senza agitazione.

Poiché le strutture replicanti con regioni a singolo filamento o punti di ramificazione sono più soggette a rottura meccanica, tagliare la punta delle pipette con una lametta per allargarne l'imboccatura e ridurre al minimo le forze di taglio. In generale, è consigliabile limitare al minimo le operazioni di pipettaggio e di agitazione fino a quando il DNA non è stato digerito con enzimi di restrizione; dopo la lisi, aggiungere proteinasi K e sarcosina e proseguire l'incubazione per un'ora. Questo passaggio serve a liberare i frammenti di DNA associati alle proteine.

Poiché il DNA in replicazione attiva è spesso legato a complessi proteici o di membrane, ciò contribuisce ad aumentare il rendimento dei frammenti di replicazione. Dopo un'ora, estrarre i campioni aggiungendo due volumi di fenolo a ciascun campione e capovolgendo delicatamente i tubi per cinque minuti. Quindi aggiungere due volumi di cloroformio, isoamilico, alcol, e capovolgere delicatamente i tubi per ulteriori cinque minuti.

Successivamente, centrifugare i campioni a 14.000 g in una microcentrifuga per cinque minuti e trasferire la fase acquosa superiore di ciascun campione in una provetta pulita. Aggiungere quindi quattro volumi di alcol ISO cloroformio e, nuovamente, capovolgere delicatamente le provette per cinque minuti. Centrifugare nuovamente i campioni a 14.000 g per cinque minuti.

Posizionare una membrana da dialisi su 250 millilitri di 0.1 xte in un becher e applicare 100 microlitri di ogni campione sulla membrana. Lasciare dializzare i campioni per un'ora dopo la dialisi. Trasferire 80 microlitri di ogni campione in una nuova provetta da 1,5 millilitro contenente 20 microlitri di mix enzimatico.

Digerire i campioni durante la notte a 37 gradi Celsius. PV due linearizza il plasmide appena a valle dell'origine di replicazione. Prima di caricare il gel di agarosio, aggiungere 100 microlitri di cloroformio e 20 microlitri di colorante di carico sei x contenente bromo.

Fenolo blu e xilene cianolo aggiunti a ogni campione e la miscelazione con cloroformio rimuoveranno qualsiasi residuo di PV due legato alle estremità del DNA. Iniziare l'analisi bidimensionale su gel di agarosio eseguendo i campioni di DNA digeriti nella prima dimensione. Caricare innanzitutto un marcatore di dimensione Lambda Hind tre nella prima corsia di un gel di agarosio 0,4% precedentemente preparato in 1X TBE.

Quindi caricare 40 microlitri della fase acquosa contenente il colorante di caricamento per ogni campione, saltando le corsie per facilitare il taglio del gel. Dopo l'elettroforesi, eseguire la prima dimensione a un volt per centimetro per circa 12-15 ore. La bassa tensione e il gel di AGROS a bassa percentuale servono a separare i frammenti di DNA principalmente in base alla dimensione.

Dopo aver eseguito la prima dimensione, utilizzare un grande coltello da macellaio per ritagliare la prima corsia contenente il marcatore Lambda HindIII e colorare con bromuro di ateridio. Per la seconda dimensione, ritagliare le corsie del gel utilizzando il coltello da macellaio e il marcatore Lambda HindIII come guida di riferimento, scartando la regione al di sotto della posizione in cui ci si aspetta che il plasmide linearizzato migri in ciascuna corsia. Per realizzare la seconda dimensione, posizionare ogni frammento orizzontalmente lungo il bordo superiore di un supporto per gel vuoto.

Preparare una soluzione di AROS al 1% in un XTBE e raffreddarla a 55 gradi Celsius. Una volta raffreddata, versare la soluzione del gel per realizzare la seconda dimensione, assicurandosi di coprire completamente le fette di gel. È importante garantire che le fette siano orientate uniformemente e che il supporto sia in bolla prima di versare il gel.

Una volta che il gel si è solidificato, eseguire la seconda dimensione per cinque ore e mezza fino a sette ore a 6,5 volt per centimetro in un apparato di elettroforesi che permette al tampone di ricircolare; il gel ad alta percentuale di agarosio separa efficacemente i frammenti di DNA in base alla loro forma oltre che alle dimensioni. Le forme non lineari migrano più lentamente attraverso la seconda dimensione dopo l'elettroforesi. Risciacquare il gel una volta con acqua, quindi lavarlo due volte in 400 millilitri di acido cloridrico 0,25 molare per 15 minuti con agitazione delicata.

I lavaggi acidi hanno lo scopo di intaccare parzialmente le molecole di DNA, frammentandole in pezzi più piccoli che si trasferiscono in modo più efficiente durante l'analisi Southern; tali lavaggi sono necessari a causa delle grandi dimensioni e della forma insolita degli intermedi della replicazione del DNA. Per preparare il gel al trasferimento alcalino, risciacquare nuovamente il gel in acqua, quindi lavarlo due volte in 400 millilitri di idrossido di sodio 0,4 molare per 30 minuti. Il DNA presente nei gel viene quindi trasferito su una membrana di nylon ad alto legame n+ mediante un sistema di trasferimento alcalino verticale discendente, utilizzando idrossido di sodio 0,4 molare come descritto nella parte scritta di questa procedura; lasciare avvenire il trasferimento del DNA per sei-dodici ore. Al termine del trasferimento del DNA, procedere con l'ibridazione della sonda come indicato nel protocollo scritto.

Dopo aver effettuato la sonda sulla membrana e averla lavata, posizionare la membrana su un tovagliolo di carta finché il liquido non sarà visibilmente scomparso. Quindi avvolgere la membrana in una pellicola di cloruro di polivinile e esporla a uno schermo di un fospoimager. Infine, la radioattività può essere visualizzata e quantificata utilizzando un Storm Eight 40 e il software associato Image Quant.

Il profilo di migrazione del plasmide PBR 322 digerito con PV, osservato mediante analisi in gel aros 2D, è schematizzato. I plasmidi lineari non replicanti migrano come frammento lineare di 4,4 kb, mentre i plasmidi replicanti formano strutture a forma di Y che migrano più lentamente rispetto ai frammenti non replicanti a causa delle loro maggiori dimensioni e della conformazione non lineare. Questo profilo di migrazione forma un arco che si estende dalla regione lineare verso il pozzetto dopo irradiazione con UV.

Si osservano molecole a forma di doppia Y o X nella regione del cono e queste migrano più lentamente rispetto all'arco di molecole a forma di Y. Un esempio dell'analisi southern su gel 2D sonda con PBR 3 22 marcato con P 32 è mostrato per cellule immediatamente dopo l'irradiazione con UV e 15 minuti dopo l'irradiazione con UV immediatamente dopo l'irradiazione con UV. Circa l'1% del DNA plasmidico totale può essere trovato nell'arco Y quando le cellule sono in rapida crescita nella fase esponenziale successiva a una radiazione.

Si osserva un aumento transitorio di molecole a forma di YS quando le forcelle di replicazione bloccate si accumulano in corrispondenza di siti danneggiati. Gli intermedi di replicazione a forma di L si accumulano anch'essi in modo transitorio e persistono fino a un momento che corrisponde al tempo di riparazione delle lesioni. Vi abbiamo appena mostrato come visualizzare gli intermedi della riparazione del DNA mediante elettroforesi su gel bidimensionale.

Quando si esegue questa procedura, è importante prestare attenzione alle forze di taglio che possono ridurre il rendimento e trattare con delicatezza tutti i campioni e i gel. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.