Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la tossicità del peptide beta amiloide in un sistema modello InVivo. La riproducibilità e la relativa semplicità di questo saggio consentono un rapido test di farmaci, condizioni ambientali o modifiche genetiche sulla tossicità del peptide beta amiloide. Un fattore chiave nello sviluppo di questo saggio è la generazione di vermi transgenici di cl egan's con espressione muscolo-specifica indotta termicamente del peptide beta amiloide.

Questa espressione sensibile alla temperatura è ottenuta ingegnerizzando un transgene che contiene una regione non tradotta tre primica insolitamente lunga, rendendo l'mRNA del transgene un bersaglio del sistema di sorveglianza dell'mRNA. L'espressione di questo transgene è pertanto scarsa nei vermi di tipo selvaggio dotati di un sistema di sorveglianza dell'mRNA funzionante, a causa della degradazione dell'mRNA del transgene. Se questo transgene viene introdotto in un contesto genetico che presenta una mutazione in un componente essenziale del sistema di sorveglianza dell'mRNA, l'espressione del transgene sarà significativamente più elevata. Se il contesto genetico presenta una mutazione sensibile alla temperatura nel sistema di sorveglianza dell'mRNA, allora la propagazione di questa linea transgenica alla temperatura non permissiva bloccherà la degradazione dell'mRNA del transgene e porterà a un'elevata espressione del transgene. I vermi transgenici che utilizzano questo sistema per regolare l'espressione del peptide beta-amiloide nei muscoli della parete corporea mostrano, con un aumento della temperatura da 16 gradi Celsius a 25 gradi Celsius, un elevato accumulo del peptide beta-amiloide, disfunzione delle cellule muscolari e paralisi dei vermi. La misurazione del tempo impiegato per questi effetti è utilizzata come indicatore.

È necessaria una popolazione di questi vermi trenchgeni per osservare la paralisi dopo l'aumento della temperatura. Il test di paralisi costituisce un saggio sensibile della tossicità del beta amiloide. Questo risultato si ottiene preparando piastre fresche di terreno di crescita per nematodi per il saggio di paralisi, il che contribuisce a minimizzare le variabili ambientali che potrebbero influenzare i tassi di paralisi.

Come secondo passaggio, vengono avviate popolazioni di vermi transgenici sincronizzati per età, minimizzando così gli effetti dello stadio di sviluppo sull'espressione del transgene. Successivamente, i vermi sincronizzati allo stadio larvale L3 vengono trasferiti da 16 gradi Celsius a 25 gradi Celsius, aumentando la stabilità dell'mRNA del transgene e inducendo l'accumulo del peptide beta amiloide. La misurazione del tempo trascorso dal trasferimento all'insorgenza della paralisi per ciascun verme consente di valutare la velocità di disfunzione muscolare, permettendo così di analizzare gli effetti tossici derivanti dall'accumulo del peptide beta amiloide; i risultati ottenuti mostrano l'effetto di trattamenti specifici sulla tossicità del peptide beta amiloide espresso endogenamente.

Il principale vantaggio della nostra tecnica, rispetto all'uso di modelli di topo transgenici per saggiare l'attività di un farmaco, è che possiamo eseguirla molto più rapidamente e a un costo notevolmente inferiore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. L'assegnazione del punteggio ai vermi L4 in un saggio di paralisi è molto difficile da apprendere.

Pertanto, quando si valuta un verme paralizzato di L4, ciò su cui ci si deve concentrare è il movimento isolato a cerchio della regione cefalica del verme. Una volta che questa parte si muove e l'intero corpo del verme è paralizzato, si considera il verme come paralizzato. I saggi di paralisi vengono eseguiti su piastre contenenti terreno di crescita nematodico standard, o NGM, comunemente utilizzato per la propagazione e la genetica di C. elegans.

Per preparare le piastre da autoclavare, sterilizzare in autoclave la soluzione NGM contenente cloruro di sodio, agar e peptone in un matraccio erlenmeyer, quindi aggiungere le quantità appropriate delle seguenti soluzioni sterili, disponibili nel protocollo scritto allegato. Aliquotare 10 millilitri di NGM liquido in ciascuna piastra di Petri di 60 millimetri per 15 millimetri. Lasciare solidificare il NGM durante la notte a temperatura ambiente.

Se si esegue il test sugli effetti di composti o estratti, aliquotare l'estratto su ciascuna piastra e utilizzare un'apposita spatola per distribuirlo uniformemente sulla superficie della piastra. Lasciare asciugare le piastre tutta la notte a temperatura ambiente. Volumi superiori a un millilitro richiederanno più tempo per l'essiccazione.

Successivamente, aggiungere su ciascuna piastra 250 microlitri di ceppo di e coli OP 50 coltivato in brodo LB per tutta la notte fino a una densità ottica compresa tra 0,4 e 0,6; lasciare asciugare le piastre tutta la notte a temperatura ambiente. L'età della piastra influisce in modo significativo sulla percentuale di paralisi, e in particolare le piastre più vecchie tendono a seccarsi. Le piastre devono essere preparate entro una settimana dall'esecuzione del saggio di paralisi.

È preferibile utilizzare piastre preparate da tre a quattro giorni prima; tutte le piastre con uova sincrone utilizzate in un esperimento devono provenire dallo stesso lotto. Modificare le dimensioni del prato batterico e/o il tipo di batteri può alterare il comportamento dei vermi. I saggi di paralisi possono essere eseguiti utilizzando ceppi alternativi di e coli. Ad esempio, HT one 15 viene utilizzato negli esperimenti di RNAi. Tuttavia, ciò potrebbe modificare la cinetica del saggio di paralisi.

Pertanto, è necessario utilizzare controlli interni appropriati al ceppo. Il ceppo CL 476 è il più comunemente usato per il saggio della paralisi indotta da beta. Questo ceppo e altri modelli transgenici sono disponibili per i ricercatori accademici a un costo simbolico presso il Saint Ahadi Genetic Center.

Per massimizzare la sincronia d'età della popolazione in esame, è preferibile iniziare con una generazione parentale sincronizzata. Una settimana prima di avviare il saggio di paralisi della popolazione in esame, utilizzare un trasferitore di worm in platino per trasferire da 20 a 30 adulti gravidi su diverse piastre NGM da 10 centimetri.

Spargere con OP 50 e far deporre le uova per due ore a 16 gradi Celsius, che è la temperatura permissiva per CL 4 1 76. Rimuovere gli adulti GR e lasciare che la prole si sviluppi per sette giorni, al termine dei quali raggiungerà lo stadio di adulti gravidi di secondo giorno. Adulti gravidi di secondo giorno.

Gli adulti vengono utilizzati per preparare popolazioni di prova di età sincronizzata per ciascuna condizione sperimentale. L'obiettivo è generare piastre in triplice replicato contenenti da 50 a 75 vermi di età sincronizzata utilizzando un trasferitore di vermi in platino. Trasferire da 10 a 12 adulti gravidi del giorno su piastre NGM da 60 millimetri inoculate con OP50. Lasciare che i vermi depongano le uova a 16 gradi Celsius per due ore, quindi rimuovere gli adulti e lasciare che le uova si schiudano e si sviluppino a 16 gradi Celsius.

A questo punto, è preferibile che qualcuno che non valuterà le piastre provveda a codificarle, in modo che la valutazione avvenga in cieco rispetto alle condizioni sperimentali. Lo stadio di sviluppo embrionale al momento della deposizione delle uova, che corrisponde approssimativamente allo stadio di 26 cellule per vermi di tipo selvatico in condizioni ottimali, dipende dall'età e dalla nutrizione degli adulti. Se gli adulti utilizzati per la deposizione delle uova sono più anziani o sono stati sottoposti a digiuno, verranno deposte uova in stadi più avanzati e non si otterrà una popolazione sincrona, compromettendo così la cinetica del saggio di paralisi.

È essenziale utilizzare colture batteriche monogeniche come e coli, OP 50, poiché qualsiasi contaminazione batterica può compromettere gravemente questo saggio. La riproducibilità è massima se le piastre in triplicato presentano un numero simile di vermi per indurre il transgene ed eseguire il saggio di paralisi. Portare le piastre a 25 gradi Celsius.

48 ore dopo la fine della deposizione sincronizzata delle uova, i vermi dovrebbero trovarsi allo stadio larvale L3. Le piastre devono essere disposte senza essere impilate in un incubatore a 25 gradi Celsius, in modo che raggiungano questa temperatura. Allo stesso tempo, iniziare a valutare la paralisi dei vermi da 18 a 20 ore dopo l'inizio dell'aumento della temperatura.

A questo punto, tutti i vermi della popolazione dovrebbero aver raggiunto lo stadio larvale quattro; continuare a valutare ogni due ore fino a quando tutti i vermi su ciascuna piastra non risultano paralizzati. Per motivi sconosciuti, la paralisi non si distribuisce in modo uniforme lungo la lunghezza del corpo. La regione cefalica è l'ultima parte del verme a cessare i movimenti.

Pertanto, i vermi che hanno recentemente iniziato la paralisi non possono spostarsi attraverso la piastra, ma possono muovere la testa, rimuovendo così i batteri intorno alla loro estremità anteriore e lasciando un alone di batteri eliminati. Questi vermi diventeranno invariabilmente completamente paralizzati e, di conseguenza, i vermi con aloni vengono classificati come paralizzati. Alcuni vermi non presenteranno aloni, ma non mostreranno neppure movimenti spontanei.

Questi vengono testati pungendoli con il worm picker. Se un verme pungendo non è in grado di effettuare la propagazione dell'onda corporea completa, viene anch'esso considerato paralizzato ai fini di una valutazione efficiente. È più semplice spostare i vermi paralizzati in un settore della piastra senza spot, in modo che non vengano rivalutati accidentalmente nel successivo periodo di valutazione.

Questo consente anche ai vermi classificati erroneamente di mostrare movimento, permettendo una correzione nel punteggio per generare una curva di paralisi. A ogni punto temporale, la frazione di vermi su ciascuna piastra che non sono ancora paralizzati viene convertita in una percentuale, e la percentuale media non paralizzata viene riportata in funzione del tempo trascorso dall'inizio dell'upshift. La curva risultante è formalmente analoga a una curva di sopravvivenza e può quindi essere analizzata utilizzando statistiche standard non parametriche per la sopravvivenza.

L'upshift dei vermi transgenici myo three A beta deve essere eseguito entro la fase L4 intermedia affinché venga avviata la paralisi. Il promotore Myo three è regolato nello sviluppo. Una volta che i vermi hanno raggiunto la fase L4 tardiva o l'età adulta, il livello di espressione è notevolmente diminuito.

L'espressione del transgene è bloccata se i vermi vengono privati del cibo, quindi è molto essenziale che i vermi siano ben nutriti per tutta la durata dell'esperimento. Non abbiamo mai osservato un verme paralizzato riprendersi in alcuna condizione. Dopo 12-16 ore di aumento della temperatura, CL 41 76 diventerà paralizzato, indipendentemente dal fatto che lo si riporti a 16 gradi; nella ceppa CL 41 76, l'upregolazione dell'espressione del transgene che causa la paralisi può verificarsi anche a temperature più basse.

Tuttavia, si noti che la velocità di paralisi sarà influenzata nei suoi tempi. La velocità di paralisi dipende dalla specifica linea transgenica utilizzata. Abbiamo costruito tre ceppi di myo con A beta che presentano una velocità di paralisi rispettivamente più rapida e più lenta rispetto al CL4176, e pertanto è necessario regolare la finestra temporale di valutazione per il saggio di paralisi di conseguenza.

Qui è mostrato un grafico della curva di paralisi per CL 4 1 76, sia non trattato che esposto a caffeina 6,27 millimolare. Questo trattamento determina un ritardo altamente significativo dal punto di vista statistico nella paralisi di circa quattro ore, che interpretiamo come indicativo di una soppressione della tossicità beta. In questo modello, questo esperimento ha analizzato gli effetti di un altro composto presente nel caffè.

Il grafico è tipico per trattamenti che non influenzano la tossicità beta. Si noti che in entrambi gli esperimenti, circa la metà delle popolazioni di CL 4 1 76 non trattate sono paralizzate a 24 ore e la paralisi è completa entro 28 ore. Questi sono intervalli temporali tipici per la paralisi del controllo.

Popolazioni CL 4 1 7 6: deviazioni significative da questi tempi indicano condizioni ambientali alterate o delezione spontanea di copie del transgene. Consultare il protocollo allegato per ulteriori informazioni sul ceppo CL 4 1 76. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante tenere presente l'età delle piastre, lo stadio della popolazione di vermi e la capacità di valutare la percentuale di paralisi dei vermi.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea di come utilizzare questo sistema con l'alghe marine per saggiaire con attenzione la tossicità del beta amiloide. Si dovrebbe essere in grado di rilevare effetti piuttosto sottili su questa tossicità causati da diverse condizioni ambientali o trattamenti farmacologici. Le variabili di cui abbiamo parlato sono importanti da considerare perché permetteranno di eseguire il saggio in modo molto riproducibile e con una cinetica di paralisi costante.

Questo è effettivamente molto importante se si desidera confrontare i risultati ottenuti nel proprio laboratorio in momenti diversi da persone diverse, oppure confrontare i propri risultati con quelli di altri ricercatori che utilizzano questo sistema modello.