Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare in modo non invasivo le alterazioni metaboliche in tempo reale a livello dell'intero organismo, nel contesto della glicolisi, del metabolismo del piruvato e del ciclo dell'acido tricarbossilico, causate da singole vie metaboliche, alterazioni genetiche e/o trattamenti farmacologici. Questo viene ottenuto somministrando isotopi stabili a nematodi viventi, al fine di garantire un arricchimento isotopico sufficiente in un numero maggiore di metaboliti, permettendo così la quantificazione delle alterazioni genetiche e/o farmacologiche nelle vie metaboliche intermedie. Come secondo passaggio, l'incorporazione isotopica nell'anidride carbonica atmosferica e disciolta viene misurata mediante spettrometria di massa con rapporto isotopico dei gas, fornendo una valutazione più diretta del flusso metabolico intermedio in brevi periodi di tempo.

In seguito, i campioni vengono analizzati per determinare l'analisi degli amminoacidi liberi nell'intero verme mediante HPLC, nonché il loro arricchimento isotopico mediante GCMS per amminoacidi e acidi organici, al fine di quantificare le alterazioni del flusso metabolico nei nematodi. Dopo l'esposizione all'isotopo stabile, si ottengono risultati che mostrano gli effetti di diverse durate di esposizione all'isotopo, della rimozione batterica e di metodi alternativi di rottura del verme in ceppi selvatici, per analizzare l'abbondanza isotopica nei metaboliti intermedi. Questo metodo può fornire informazioni sul ruolo del metabolismo intermedio.

È inoltre applicabile ai nostri sistemi come linee cellulari di mammifero e tessuti. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato anomalie costanti nell'analisi degli aminoacidi liberi nei vermi mediante HPLC, suggeritive di un flusso metabolico intermedio alterato in seguito a cambiamenti primari della funzione respiratoria. Per iniziare questa procedura.

Verme esposti a un precursore metabolico marcato con isotopo stabile durante lo sviluppo o nell'età adulta vengono raccolti in un tubo centrifugo di plastica da 1,5 millilitri. Di solito diluiamo i vermi fino a una concentrazione di 1000 vermi per un millilitro. Aggiungere acido perclorico al 60% contenente acido epsilon-aminocaproico come standard interno ai vermi, fino a una concentrazione finale di acido perclorico al 4% e 20 nanomolar dello standard interno.

Lasciare sedimentare il verme per gravità per cinque minuti, quindi rimuovere e conservare il soprannatante in un altro tubo. Il passaggio seguente è uno degli aspetti più critici di questa procedura. I vermi devono essere completamente disintegrati mediante setacciatura prima dell'analisi dei metaboliti liberi. Utilizzando un omogeneizzatore di plastica e un trapano motorizzato, macinare i campioni di vermi per 15 secondi.

Verificare visivamente l'interrompimento dei vermi mediante microscopia ottica e ripetere la macinazione se necessario. In questa immagine, i pannelli A e B mostrano vermi prima della macinazione. In contrasto con i pannelli C e D che mostrano vermi dopo la macinazione, trasferire il soprannatante precedentemente conservato nei tubi centrifuga in plastica da 1,5 millilitri con l'omogenato di vermi e centrifugare.

Campioni a 2.250 giri/min, 1300 G, per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo di vetro da sette millilitri. Conservare il pellet per un successivo utilizzo in un saggio di concentrazione proteica.

Ora aggiungere quattro idrossido di potassio normale al soprannatante fino a quando il pH dei campioni è compreso tra sette e otto. Centrifugare i campioni neutralizzati nei tubi di vetro da sette millilitri a 2.250 giri al minuto (1.300 G) per cinque minuti. Per rimuovere i sali, trasferire il soprannatante di ogni campione in un nuovo tubo di vetro da sette millilitri. I campioni neutralizzati possono ora essere preparati per la quantificazione dei metaboliti mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC e cromatografia gassosa con spettrometria di massa o GCMS per HPLC.

Separare 50 microlitri di ciascun campione neutralizzato per l'iniezione diretta nell'HPLC. La quantificazione degli amminoacidi liberi viene eseguita mediante derivatizzazione in prec colonna con aldeide e rilevamento fluorescente. Come descritto in precedenza, i campioni neutralizzati rimanenti saranno sottoposti ad estrazione utilizzando una resina a scambio ionico per GCMS al fine di determinare l'arricchimento isotopico in amminoacidi e acidi organici, come mostrato nella prossima sezione.

Per preparare le perle, aggiungere un acido cloridrico normale rispettivamente a G una e a G 50 perle separatamente. In beker da un litro, agitare ciascun flacone per 30 minuti con un agitatore magnetico. Successivamente, lavare le perle con acqua deionizzata 10 volte fino a quando il pH dei lavaggi risulti uguale al pH dell'acqua.

Successivamente, illustreremo il nostro metodo per preparare colonne personalizzate a basso costo utilizzando pipette di vetro. Colonnes preassemblate sono inoltre disponibili in commercio. Per preparare una colonna, utilizzare una pinzetta per inserire un tappo di cotone appena sopra la parte più stretta della punta di una pipetta Pasteur, usando perle G one per l'estrazione degli acidi organici e perle G 50.

Per l'estrazione degli aminoacidi, riempire ogni colonna fino a circa un terzo dell'altezza della colonna. Se un campione è già a pH neutro, non si aggiunge nulla al campione prima di applicarlo sulla colonna AG 1. Per estrarre gli acidi organici ed estrarre gli aminoacidi, aggiungere un millilitro di acido cloridrico 0,1 N al campione prima di applicarlo sulla colonna AG 50.

Ora applicare i campioni neutralizzati precedentemente preparati su ciascuna colonna. Lavare ogni colonna 10 volte con acqua fino a quando i lavaggi risultano neutri. Al termine del lavaggio, eluire ciascuna colonna in provette campione di vetro fresche e etichettate da quattro millilitri. Per l'estrazione degli acidi organici, aggiungere tre millilitri di acido cloridrico tre normale alla colonna AG una.

Questo consente l'analisi dell'arricchimento isotopico nel numero totale di carboni marcati tra specie a tre carboni, specie a quattro carboni, specie a cinque carboni e specie a sei carboni. Per l'estrazione degli aminoacidi, aggiungere tre millilitri di ammoniaca 4 N a una colonna G 50. Questo consente l'analisi dell'arricchimento isotopico nel numero totale di carboni marcati tra specie a tre carboni e specie a cinque carboni.

Al termine delle estrazioni di acidi organici e aminoacidi, posizionare le provette campione in un evaporatore reattivo a tre posti per tutta la notte fino a completa essiccazione. I campioni vengono quindi derivatizzati e analizzati mediante GCMS come descritto nel testo del protocollo. Iniziare questa procedura trasferendo mille worm adulti giovani in una piastra sperimentale NGM agar da 35 millimetri contenente glucosio marcato universalmente con carbonio 13 ed E. coli.

Posizionare successivamente la piastra NGM sperimentale senza il coperchio all'interno di una camera di vetro personalizzata, dotata di un rubinetto a tre vie ben sigillato, che permette un campionamento e una sostituzione precisi dell'atmosfera. Sigillare con grasso ad alto vuoto il punto in cui il disco di vetro otticamente trasparente poggia sulla piastra.

Sigillare la camera con il disco di vetro. Registrare il tempo. Al tempo zero e 30 minuti dopo, utilizzare una siringa da 20 millilitri per prelevare 10 millilitri dell'atmosfera dalla camera di vetro attraverso il rubinetto a tre vie.

Chiudere il rubinetto a chiusura verso la camera. Dopo il campionamento, trasferire il campione in un tubo di vetro sottovuoto rosso contenente un millilitro di bicarbonato di sodio in idrossido di sodio 0,1 molare. Successivamente, iniettare 10 millilitri di aria nella camera di vetro attraverso il rubinetto a tre vie. Utilizzando una siringa da 20 millilitri, chiudere il rubinetto verso la camera dopo aver re-iniettato l'atmosfera e, prima di riprendere l'incubazione, ripetere il campionamento dell'atmosfera dalla camera di vetro a 60, 90 e 120 minuti.

Analizzare questi campioni di anidride carbonica atmosferica per valutare l'arricchimento in carbonio marcato utilizzando uno spettrometro di massa per rapporti isotopici gassosi, come descritto nel testo del protocollo. Gli isotopi stabili vengono efficacemente incorporati entro due ore nei vermi adulti giovani, come dimostrato qui dal carbonio marcato rilevato nell'anidride carbonica atmosferica e nell'anidride carbonica disciolta nei vermi, alimentati sia con OP50 E. coli vivo sia con OP50 E. coli ucciso mediante irraggiamento UV. Il rapporto tra anidride carbonica con carbonio 13 e anidride carbonica con carbonio 12 è risultato maggiore nella frazione di anidride carbonica disciolta nei vermi rispetto a quella rilasciata nell'atmosfera. È stato osservato che un'esposizione prolungata a un isotopo stabile a partire dal periodo larvale, seguita da un lavaggio dei vermi su agar NGM privo di batteri, aumenta l'arricchimento isotopico del glutammato libero nei vermi adulti giovani.

In questo grafico, L1 rappresenta vermi alimentati con glucosio marcato universalmente al carbonio 13 e batteri OP50 dallo stadio larvale L1 fino allo stadio di adulto giovane a 959 cellule; YA rappresenta vermi alimentati con glucosio al carbonio 13 e batteri OP50 per 48 ore a partire dal primo giorno della deposizione delle uova, allo stadio di adulto giovane. L'asse X indica il numero totale di atomi di carbonio marcati in ciascuna specie di glutammato, e l'asse Y indica il percentuale di arricchimento. Tutti gli animali sono stati sottoposti a rimozione dell'eccesso di marcatura isotopica prima della preparazione del campione per le analisi successive.

Per le analisi GCMS, le barre verdi indicano vermi depurati dopo l'esposizione isotopica mediante alimentazione con E. coli OP50 su piastre NGM per due ore prima dell'estrazione con PCA. Le barre blu e grigie indicano vermi depurati dopo l'esposizione isotopica su piastre NGM senza batteri per due o sei ore rispettivamente prima dell'estrazione con PCA, indipendentemente dal tempo di esposizione isotopica. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'arricchimento isotopico dei metaboliti intermedi quando gli animali sono stati depurati sulle piastre per due o sei ore.

In entrambi i percorsi di esposizione isotopica, si è osservato un minore arricchimento isotopico nei metaboliti intermedi quando gli animali sono stati depurati nutrendoli con batteri non marcati per due ore. Pertanto, il protocollo di depurazione ottimale per i vermi coltivati su piastre NGM con batteri e isotopo è stato determinato in due ore di depurazione su piastre NGM senza batteri, al fine di ottimizzare la percentuale di arricchimento nei metaboliti intermedi. Successivamente al trattamento per 24 ore in coltura liquida con un glucosio marcato al carbonio 13 a sei atomi di carbonio in assenza di batteri.

È stato effettuato un confronto tra campioni di vermi sottoposti a rottura mediante sonicazione soltanto o sonica游戏副本

Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca sulle malattie mitocondriali, permettendo di esplorare il flusso metabolico intermedio in *Caenorhabditis elegans*. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il profilo isotopico stabile del metabolismo intermedio e del flusso metabolico nei nematodi, *C. elegans*.