Di base

In questo video, ti mostreremo come sincronizzare C. elegans allo stadio di prima istar. Si tratta di un metodo semplice, ma molto comune, quindi sarà molto utile, specialmente se sei ancora un principiante.

Se si è esperti in C, si possono trovare qui alcuni suggerimenti per ottimizzare questo protocollo. La base della sincronizzazione dei vermi risiede nella resistenza relativa dei larvacei ed embrioni rispetto alla soluzione alcalina di ipoclorito che uccide gli adulti. Gli adulti di questi vermi, contenenti molti embrioni al loro interno, vengono incubati con una soluzione di ipoclorito in modo da essere eliminati, lasciando soltanto gli embrioni.

La seconda parte della sincronizzazione si ottiene attraverso la mancanza di cibo, in modo che, anche se gli embrioni si sviluppano in momenti diversi, non progrediscano oltre lo stadio L uno. Il primo passo per avviare un protocollo di blitzing è avere vermi allo stadio di deposizione delle uova, con diverse uova sparse sulla piastra. Utilizzare M nove per recuperare gli adulti al fine di raccoglierli.

Inoltre, gli embrioni che hanno già raggiunto la superficie della piastra possono essere prelevati con un materiale morbido, come un pezzo di pellicola radiografica, per rimuovere i batteri mediante diversi lavaggi con M9. Di solito bastano un paio di lavaggi. Una volta lavati i vermi, è il momento di aggiungere la soluzione di sbiancamento appena preparata secondo le nostre preferenze.

Controllare il tempo di incubazione mentre si agita il tubo. È possibile monitorare la comparsa degli adulti al microscopio stereoscopico. Una volta che quasi non rimangono carcasse, interrompere la reazione aggiungendo M nine fino a riempire completamente il tubo.

Per completare il protocollo, eseguire almeno tre lavaggi. Con M nine, le uova vengono incubate con agitazione continua per tutta la notte in tampone M nine, il che permette la schiusa ma impedisce lo sviluppo ulteriore dei vermi. Sebbene la sincronizzazione possa essere effettuata a qualsiasi temperatura compresa tra 15 e 25 gradi, si raccomanda 15 °C.

Poiché lo sviluppo è più lento, come abbiamo menzionato durante il suo ciclo evolutivo, *C. elegans* attraversa quattro stadi larvali prima di raggiungere l'età adulta, per un tempo che dipende dalla temperatura alla quale viene allevato. Mentre il ceppo di tipo C di *C. elegans* tollera temperature di crescita comprese tra 15 e 25 gradi, il tasso di crescita è maggiore.

La temperatura superiore qui, si può vedere come dopo 24 ore, gli stadi in cui si trovano i vermi siano diversi. A 15 e 25 gradi dopo 48 ore a 25 gradi, osserviamo già embrioni. Tuttavia, dobbiamo aspettare più di 80 ore per vedere embrioni sulla superficie delle piastre.

Per ottenere risultati ottimali con vermi coltivati a 15 gradi, è necessario prendere in considerazione diversi aspetti quando si esegue un esperimento di blitzing. È inoltre importante riconoscere i vermi che si trovano nello stadio desiderato per l'esperimento. Di seguito verrà mostrato come distinguere gli stadi, sia in base alle dimensioni, sia mediante microscopia a interferenza differenziale, sia con la colorazione.

In questo grafico, è possibile osservare la velocità di crescita dei vermi di GaN in funzione della temperatura, come abbiamo detto, crescono molto più rapidamente a 25 gradi. Esiste una correlazione tra la dimensione dell'animale e lo sviluppo negli elementi marini. Con il software appropriato, gli animali possono essere misurati e successivamente classificati nello stadio di sviluppo corretto.

Secondo questo grafico, tuttavia, il sito rappresenta un marcatore grossolano delle fasi di sviluppo. Una definizione più concordata delle fasi può essere ottenuta osservando parti del corpo, anatomie che possono essere utilizzate e riconosciute mediante microscopia a interferenza differenziale, contrasto di fase o colorazione con DPI. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato questo protocollo per sincronizzare i vermi per diversi esperimenti, come microuova in colorazione monocromatica, visualizzazione in situ e colorazione con up.

Inoltre, questo protocollo ti aiuta anche a eliminare la contaminazione. Per aumentare il contrasto si utilizza la microscopia a contrasto di interferenza differenziale o la microscopia normale. In campioni trasparenti non colorati, gli animali vengono montati vivi su una base di agarosio al 2%, che può essere preparato in anticipo e conservato a quattro gradi quando necessario.

Può essere fuso e mantenuto a 65 gradi. Una volta che l'agros è fuso, applicare del nastro adesivo su un vetrino e posizionarlo su entrambi i lati di un terzo vetrino. Prelevare con attenzione un po' di agros e depositare una goccia sul vetrino senza nastro adesivo.

Coprire gli agros con un altro vetrino posizionato in senso trasversale. Una volta che il percorso è solidificato, separare i due vetrini facendone scivolare uno con attenzione sull'altro. La striscia aderirà a uno di essi.

Aggiungere un po' di Amazon sul pad per mantenere i vermi immobilizzati. Prelevare alcuni vermi sotto il microscopio stereoscopico e trasferirli nella goccia di lele. Evitare di danneggiare il percorso.

Prendere un'oggettino e aggiungere un po' di vernice per unghie ai bordi. Posizionare con attenzione il coprioggetto su questo vetrino evitando la formazione di bolle d'aria. Il preparato può essere osservato immediatamente al microscopio. Una delle caratteristiche più semplici dell'anatomia di c Elgan è Alva.

Ad esempio, un'aava con una forma a tre festoni natalizi è caratteristica dello stadio L quattro. Informazioni dettagliate sull'anatomia di c elgan durante lo sviluppo possono essere ottenute dal sito www.orla.org. La colorazione con tapis è una procedura comune per identificare le singole cellule.

La fissazione con il tunnel è un metodo rapido per fissare i vermi. Per la colorazione dappy, aggiungere prima una goccia di buffer M nine sulla superficie di un vetrino da microscopio. Prelevare alcuni vermi direttamente dalla piastra e trasferirli nella goccia di M nine.

Eliminare l'eccesso di M nine con una pipetta o con un fazzoletto morbido. Aggiungere un tunnel ai vermi. Ripetere l'operazione.

Una volta che la prima goccia è asciutta, aggiungere un po' di mezzo di montaggio con API e l'oversleep prima di portare il preparato al microscopio. Lo sviluppo del go può essere facilmente osservato in uno stent caldo con api.