Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Tradizionalmente, gli studi biologici e clinici che richiedono un'analisi microscopica con risoluzione a livello cellulare sono stati condotti eseguendo più esperimenti in parallelo, rimuovendo campioni singoli dallo studio in punti temporali sequenziali per la valutazione mediante microscopia ottica, mentre la microscopia confocale, a due fotoni e armonica seconda sono tutte tecniche utili per l'imaging in situ. L'infrastruttura richiesta è complessa e costosa, in quanto prevede sistemi laser a scansione e sorgenti luminose complesse. Qui dimostriamo come costruire in un solo giorno un sistema di microendoscopia a fibra ottica ad alta risoluzione, utilizzando componenti disponibili sul mercato per meno di 5.000 dollari USA.

La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione dell'immagine, campo visivo e lunghezza d'onda operativa. Innanzitutto, viene assemblata una semplice struttura per microscopio a fluorescenza in epifluorescenza per ospitare una sorgente luminosa, filtri ottici, lenti, un fascio di fibre ottiche e una telecamera CCD. Successivamente, vengono installate le lenti di imaging, che formano un'immagine ingrandita del fascio di fibre ottiche sulla telecamera CCD.

Una sorgente a LED viene quindi installata con ottiche di illuminazione al fine di fornire luce di eccitazione fluorescente al campione. Infine, utilizzando il microendoscopio assemblato, l'acquisizione di immagini in tempo reale rivela dettagli a livello cellulare di campioni marcati con fluorescenza, inclusi colture in vitro, modelli animali in vivo e soggetti umani. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale o la microscopia a due fotoni è che è sufficientemente semplice ed economica, consentendo ai ricercatori che operano in una vasta gamma di settori di implementarla rapidamente e di personalizzarla in base alle proprie esigenze specifiche.

L'endoscopio microscopico ad alta risoluzione descritto qui dovrebbe essere considerato come una configurazione di base, con diverse possibili varianti nell'assemblaggio e nell'applicazione. Nella selezione dei componenti per un'applicazione specifica, si devono considerare le relazioni intrinseche coinvolte nella microscopia a fluorescenza tra concentrazione del fluorocromo, fotodegradazione, intensità dell'illuminazione, sensibilità della telecamera, guadagno e tempo di esposizione. Questa piattaforma è progettata per essere utilizzata con la pro flavina come agente di contrasto fluorescente, ma può essere configurata per funzionare con altri coloranti fluorescenti.

Pro flavin è un colorante nucleare brillante con lunghezze d'onda di assorbimento e di emissione massime rispettivamente di 445 nanometri e 515 nanometri. L'uso di altri agenti di contrasto richiederà all'utente di selezionare opportunamente i filtri di eccitazione, di emissione e dicromatici per assemblare il sistema di microendoscopio; iniziare collegando due aste per gabbia da sei pollici a due aste per gabbia da 1,5 pollici per formare una coppia di aste lunghe 7,5 pollici. Avvitare le aste su una faccia dell'unità con specchio piegato, quindi installare uno specchio con diametro di un pollice.

Successivamente, avvitare quattro aste da 0,5 pollici sulla faccia opposta dell'unità dello specchio piegato. Inserire il cubo per gabbia nelle aste per gabbia da 7,5 pollici attraverso i due fori inferiori passanti. Avvitare le aste da due pollici sulla faccia laterale del cubo per gabbia.

Utilizzando un adattatore da attacco C a SM1, collegare la telecamera a una piastra per sistema a gabbia. Fissare la piastra del sistema a gabbia sulle aste da 0,5 pollici in modo che sia allineata con la superficie anteriore dell'unità dello specchio piegatore. Selezionare una lente tubo con diametro di un pollice per formare un'immagine del fascio di fibre ottiche sulla telecamera.

La lunghezza focale della lente deve essere selezionata in modo che la causa del fascio di fibre ottiche venga campionata da almeno due pixel. Quando si proietta l'immagine sulla fotocamera, inserire la lente in un tubo obiettivo lungo tre pollici e fissare la lente con un anello di ritenzione. Una chiave a forchetta è utile per avvitare gli anelli di ritenzione nei tubi obiettivo lunghi.

Lasciare cadere il filtro di emissione nel tubo della lente da tre pollici, posizionandolo sopra il primo anello di ritenzione, e aggiungere un altro anello per fissare saldamente il filtro. Assicurarsi che l'orientamento del filtro rispetti la convenzione indicata dal produttore. Avvitare il tubo della lente sul lato del cubo della gabbia più vicino alla telecamera CCD.

Questa posizione è mostrata anche qui. Si noti che nel diagramma, questa lente e questo filtro sono rappresentati senza il tubo per lente da tre pollici. Per chiarezza, collegare la fotocamera a un computer e visualizzare l'immagine sullo schermo.

Orientare l'insieme della gabbia verso un oggetto distante e far scorrere il cubo della gabbia lungo le rotaie finché non appare a fuoco un'immagine dell'oggetto. Utilizzare un cacciavite per serrare le quattro viti situate sui lati del cubo della gabbia. Queste viti, quando serrate, afferrano le rotaie mantenendo il cubo in posizione.

Questo garantirà che le lenti del tubo formino un'immagine focalizzata del fascio di fibre sulla fotocamera quando combinate con l'obiettivo corretto all'infinito. Successivamente, inserire lo specchio dicotomico nel supporto e posizionarlo a 45 gradi nel cubo della gabbia. Avvitare l'obiettivo tramite un adattatore filettato da RMS a SM e un tubo per lenti regolabile sulla faccia del cubo della gabbia opposta al supporto della lente del tubo.

Successivamente, avvitare un connettore SMA su una piastra della gabbia e montarla sulle aste approssimativamente alla distanza di lavoro della lente dell'obiettivo. Aggiungere la piastra di base e il tappo terminale ai lati aperti del cubo della gabbia. Quindi montare un LED su una piastra della gabbia e farlo scorrere all'estremità delle aste da due pollici.

Aggiungere una lente a un tubo porta-lente da 0,5 pollici in modo che, quando questo tubo viene avvitato lateralmente al cubo della gabbia, formi un'immagine del LED che riempia l'apertura posteriore dell'obiettivo. Inoltre, aggiungere il filtro di eccitazione al tubo porta-lente. A questo stadio, un alimentatore per LED può essere utilizzato per controllare l'intensità della luce di illuminazione mediante resina epossidica.

Collegare un connettore SMA per una fibra da 1030 micron al fascio di fibre ottiche con campo visivo da 720 micron. Per informazioni dettagliate sulla connessione delle fibre ottiche, consultare T Thor labs, numero di parte FN nine six. Una guida alla connessione e alla lucidatura delle fibre ottiche.

Avvitare il fascio di connettori SMA a occhiello nel connettore SMA montato sulle aste della gabbia. Indirizzare l'estremità distale del fascio verso una sorgente luminosa a banda larga; è sufficiente una luce fluorescente. Successivamente, osservare l'immagine della faccia prossimale del fascio sulla telecamera CCD. Infine, regolare la posizione dell'obiettivo avvitandolo dentro o fuori dal cubo della gabbia.

Finché l'immagine del fascio di fibre non appare a fuoco, la singola causa dovrebbe essere chiaramente visibile. La risoluzione spaziale del microendoscopio può essere aumentata aggiungendo una microottica o un insieme di lenti alla punta distale del fascio di fibre. Queste ottiche sono configurate in modo tale che, invece di appoggiare direttamente la punta del fascio sul tessuto, la punta viene proiettata sulla superficie del tessuto con una riduzione dem.

In tal modo si aumenta la frequenza di campionamento spaziale imposta dalla guida della luce dovuta al fascio di fibre. Il grado di riduzione dell'ingrandimento corrisponde all'aumento della risoluzione spaziale e, allo stesso tempo, a una corrispondente diminuzione del campo visivo. Selezionare una lente GRIN con l'ingrandimento e la distanza di lavoro desiderati per la propria applicazione.

Assicurarsi che il diametro della lente corrisponda a quello del fascio di fibre con cui si intende lavorare. Montare il fascio di fibre e la lente grin su basette di posizionamento manuale a tre assi separate, sotto un microscopio a basso ingrandimento o uno stereomicroscopio, per un allineamento accurato.

Successivamente, applicare una goccia di adesivo ottico sulla lente o sulla faccia del fascio. Utilizzando i posizionatori manuali, portare le due componenti a contatto. Esporre l'interfaccia alla luce UV per il tempo raccomandato dal produttore per polimerizzare l'adesivo.

Per proteggere l'obiettivo grin e l'interfaccia incollata, utilizzare un breve tratto di tubo capillare in alluminio per racchiudere il giunto. Far scorrere il tubo sul giunto e fissarlo in posizione con una goccia di resina epossidica a ciascuna estremità del tubo; utilizzare un tubo termorestringente per completare l'assemblaggio. Prima dell'imaging micro-endoscopico, applicare l'agente di contrasto sulle cellule o sul tessuto da immaginiare al fine di visualizzare le cellule e la coltura.

Prima, rimuovere il mezzo di crescita mediante pipettaggio. Quindi aggiungere la soluzione di pro flavina pipettando delicatamente nel pozzetto. Dopo un'incubazione breve di un minuto al massimo, rimuovere la soluzione di pro flavina mediante pipettaggio e scartarla.

Lavare le cellule aggiungendo e rimuovendo una soluzione fresca di PBS nel pozzetto. Montare l'estremità distale del fascio di fibre in un supporto stabile dotato di regolazioni manuali lungo gli assi x, Y, Z per garantire stabilità. Durante l'acquisizione dell'immagine, dopo l'applicazione del colorante alle cellule o al tessuto, posizionare il fascio di fibre ottiche a leggero contatto con il campione. Visualizzare l'immagine del fascio di fibre ottiche sullo schermo del computer, utilizzando il software fornito dal produttore della telecamera o qualsiasi software personalizzato che si desideri sviluppare.

Regolare il tempo di esposizione e le impostazioni del guadagno della fotocamera per ottenere un'immagine di luminosità accettabile. Se assemblato correttamente, il microendoscopio funzionerà come un microscopio a fluorescenza in epilluminazione, trasmesso attraverso un fascio coerente di fibre ottiche. Per ottenere risultati ottimali nell'acquisizione delle immagini, è necessario prestare attenzione a garantire il rispetto di tre condizioni fondamentali.

Prima di tutto, la faccia prossimale del fascio di fibre deve essere focalizzata sulla camera CCD senza sfocatura, al fine di ottenere la massima risoluzione del sistema. Qui viene mostrata una porzione di un fascio di fibre immaginata con scarsa messa a fuoco, leggera messa a fuoco e buona messa a fuoco. La messa a fuoco ottimale si ottiene regolando la posizione effettiva dell'obiettivo rispetto alla faccia del fascio.

In secondo luogo, la faccia prossimale del fascio di fibre deve essere illuminata in modo uniforme su tutto il suo diametro. Come descritto in precedenza, ciò si ottiene configurando l'ottica di illuminazione per un'illuminazione colimata. L'immagine mostrata qui è stata acquisita quando un campione fluorescente uniforme viene illuminato in questa configurazione preferita.

Il risultato corrispondente in condizioni di illuminazione critica è mostrato qui. La struttura del LED viene proiettata sulla faccia del fascio di fibre, causando l'apparizione di questo schema indesiderato sovrapposto alla vera struttura del campione. In terzo luogo, è importante assicurarsi che entrambe le facce, prossimale e distale, del fascio di fibre siano pulite e prive di graffi e scheggiature.

In questo esempio, dei detriti sono attaccati alla superficie del fascio e un danno sotto forma di una piccola scheggiatura alle cinque è visibile sul perimetro della fibra. I detriti possono essere rimossi dalle superfici del fascio pulendo allo stesso modo dei connettori ottici convenzionali, utilizzando carta per lenti e isopropanolo oppure strumenti standard per la pulizia delle fibre ottiche. 1483 cellule sono state marcate con pro flavina e il fascio di fibre nudo è stato appoggiato leggermente sul campione.

L'imaging in vitro è mostrato qui quando una lente grin di 2,5 x è stata fissata alla punta del fascio, ottenendo un miglioramento della risoluzione spaziale e una riduzione del campo visivo. L'imaging in vivo, in cui un fascio di fibre con un diametro esterno di 0,5 millimetri è stato inserito attraverso un ago da 21 gauge ed avanzato nel tessuto del pad adiposo mammario di un topo, è stato eseguito come mostrato in questo filmato, in cui gli adipociti sono chiaramente visibili con movimento dovuto al ciclo cardiaco. In questo esempio, l'imaging della mucosa orale in un volontario umano sano è stato effettuato utilizzando un fascio di fibre più grande con un diametro esterno di 1,5 millimetri.

In tutti gli esempi, è stato utilizzato il pro flavina come agente di contrasto fluorescente per l'etichettatura nucleare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare e assemblare un microendoscopio a fibra ottica per l'imaging fluorescente in C due di cellule e tessuti.