Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

In questo video viene illustrato come costruire un microscopio confocale a scansione con frequenza video utilizzando componenti standard disponibili in commercio. Un microscopio confocale a scansione si basa sul movimento coordinato di due specchi mobili per spostare il fascio di luce lungo il piano raster: la luce proveniente dal primo specchio viene scansita orizzontalmente attraverso il primo insieme di lenti di rilè, che la focalizza nuovamente in un punto fisso sul secondo specchio mobile. Lo stesso movimento di scansione viene quindi trasmesso attraverso le lenti di scansione e tubo, posizionando il fascio di luce ormai ampliato sull'apertura posteriore della lente obiettivo.

Il secondo specchio, il cui movimento è lento rispetto al primo, scansiona contemporaneamente l'asse Y, consentendo un'azione di scansione sopra e sotto il piano illustrato e creando un reticolo rettangolare sulla superficie del campione. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto all'acquisto di un microscopio commercialmente disponibile è il basso costo e la possibilità di personalizzare lo strumento in base alle esigenze specifiche di un progetto di imaging. Quando si lavora con un qualsiasi laser, è fondamentale adottare adeguate misure di sicurezza per prevenire lesioni agli occhi.

Indossare sempre gli appositi occhiali di protezione per laser, ogni volta che possibile. Gli spettatori e/o i ricercatori che non stanno attivamente allineando o lavorando con il fascio devono indossare occhiali di protezione. Rimuovere tutti gli orologi e i gioielli lucidi e riflettenti.

Particolarmente importante è seguire e controllare costantemente il fascio terminandone il percorso con un blocco per fascio o una scheda metallica montata. Ciò è fondamentale durante l'allineamento degli specchi, poiché il percorso del fascio può essere difficile da prevedere. Inoltre, non portare mai gli occhi all'altezza del percorso del fascio.

Spegnere il laser se è necessario attraversare il piano del fascio prima di assemblare il microscopio. Assicurarsi che tutta l'attrezzatura necessaria per la costruzione sia disponibile, inclusi il banco ottico e i supporti ad angolo di 90 gradi, tutti gli specchi, le lenti e i dicotroici, insieme alle relative morse e al hardware di montaggio, entrambi gli specchi di scansione e il fotodetettore. È inoltre utile avere a portata di mano un generatore di funzioni per verificare l'azione di scansione e regolare gli specchi durante l'allineamento.

Si consiglia vivamente di fissare saldamente la breadboard per garantire stabilità. Iniziare la costruzione del microscopio posizionando il connettore a coda di maiale nel supporto ottico e collocando questo insieme al centro della breadboard ottica. Questo corrisponde all'origine del fascio blu come mostrato qui.

Accendere la sorgente luminosa. Utilizzare le viti di regolazione per regolare approssimativamente il fascio in modo che viaggi in linea retta sia orizzontalmente che verticalmente. Posizionare un diaframma davanti al collimatore della fibra.

Successivamente, regolare l'altezza dell'iride in modo che il fascio passi attraverso il centro. Quindi spostare l'iride lontano dall'ator lungo il percorso del fascio. Verificare l'allineamento del fascio.

Utilizzare le due viti di regolazione per riposizionare il fascio sull'iride, se necessario. Posizionare il mirror montato sul percorso del fascio, con il fascio laser centrato rispetto allo specchio. Ruotare il supporto dello specchio in modo da riflettere il fascio a circa 90 gradi, assicurandosi che l'altezza del fascio non cambi.

Fissare lo specchio al tavolo serrando le viti sul supporto. Successivamente, posizionare lo specchio galvanometrico risonante montato sul percorso del fascio laser, avendo cura di garantire che il fascio laser sia posizionato esattamente al centro orizzontale della superficie dello specchio.

Ruotare il supporto dello specchio in modo da riflettere il fascio laser ad un angolo di 90 gradi. Successivamente, regolare approssimativamente la riflessione sullo specchio per mantenere costante l'altezza verticale del fascio laser. Poi, prendere due iridi e posizionarle direttamente davanti al galvanometro risonante.

Quindi, utilizzando il fascio laser riflesso dallo specchio galvanometrico risonante come riferimento, regolare la loro altezza verticale come in precedenza. Ora, usando i fori filettati della tavola ottica come guida visiva, fissare i due iridi in linea retta. Regolare il primo specchio sul percorso, ossia il dicotrico, per centrare il fascio sul primo iride.

Quindi regolare lo specchio secondario nel percorso. Utilizzare il galvanometro risonante per centrare il fascio sul secondo iride. Regolare iterativamente questi due specchi finché il fascio non è allineato attraverso entrambi gli iridi.

Assicurarsi che il fascio laser riflesso dallo specchio galvanometrico risonante venga ancora riflesso approssimativamente dal centro dello specchio. Se il fascio è deviato, regolare il supporto del collimatore in fibra e ripetere le regolazioni con il fascio centrato su entrambe le iridi aperte. Il passo successivo consiste nel posizionare le due lenti di rilancio che formeranno l'immagine del primo piano telecentrico stazionario sul secondo piano telecentrico stazionario.

Per questo particolare microscopio, le lenti selezionate nel primo rilancio hanno la stessa lunghezza focale F, quindi la distanza tra i due specchi è semplicemente pari a quattro F. Per questa configurazione, F corrisponde a 90 millimetri, quindi la posizione quattro F sarà a 360 millimetri di distanza dallo specchio di scansione. Per assicurare che le lenti siano perfettamente centrate nel percorso del fascio, posizionare la prima lente nel percorso del fascio e osservare il punto del fascio laser sull'iride successiva presente nel percorso del fascio. Dopo la lente, regolare l'altezza della lente in modo che il centro verticale del fascio corrisponda al centro dell'iride.

Successivamente, regolare la posizione orizzontale del fascio in modo da centrarlo sulla pupilla. Ripetere questa procedura con la seconda lente. Successivamente, si procederà con la configurazione dello specchio di scansione e il microscopio verrà ruotato per facilitare il posizionamento e l'allineamento diretto dei componenti, che altrimenti dovrebbero essere regolati verticalmente.

Per trovare la posizione esatta del secondo piano telecentrico, collegare il galvanometro risonante all'unità di scansione e accenderlo. Utilizzare una scheda da visita per seguire il percorso del fascio di scansione attraverso le due lenti. Il secondo piano telecentrico si troverà approssimativamente a quattro F dal galvanometro installato ed è identificabile come il punto in cui il fascio di scansione appare fermo.

Segnare con una matita la basetta sotto questa posizione. Una volta identificato il piano telecentrico, impostare l'ingresso dello specchio di scansione a zero volt e accendere l'apparecchiatura di controllo dello specchio in modo che lo specchio si posizioni nella sua posizione neutra. Quindi posizionare lo specchio galvanometrico standard di scansione esattamente nella posizione del piano tele.

Regolare la posizione dello specchio in modo che il fascio nel piano tele colpisca esattamente il centro dello specchio di scansione e serrare il supporto dello specchio. Ora allentare la vite di bloccaggio che tiene lo specchio gal e ruotarlo, assicurandosi che il fascio si propaghi verticalmente. Spegnere ora il laser e l'elettronica di scansione.

Scollegare la fibra e disconnettere gli specchi di scansione. Quindi, utilizzando staffe di montaggio ad angolo di 90 gradi, fissare il secondo basamento al primo.

Infine, ruotare con attenzione l'intero microscopio in modo che la nuova breadboard sia posizionata in piano e utilizzare la morsetta per fissare il microscopio in posizione. Ricollegare qui il galvanometro e il laser e ricordarsi di riportare il galvanometro a zero volt. Il resto dell'allestimento, precedentemente verticale, può essere facilmente realizzato sulla breadboard piana.

Successivamente, allestiremo il secondo insieme di lenti di rilè noto formalmente come lente di scansione e lente del tubo. Si prega di consultare il protocollo scritto allegato per informazioni molto importanti sulla scelta della combinazione corretta di lenti. Iniziare configurando le lenti.

Per prima cosa, posizionare gli specchi necessari per indirizzare il fascio fino all'obiettivo. Posizionare il primo specchio grande da due pollici vicino al bordo della tavola ottica e ruotare il supporto dello specchio in modo da riflettere il fascio laser di circa 90 gradi approssimativamente. Regolare la riflessione sullo specchio per mantenere costante l'altezza verticale del fascio.

Quindi posizionare l'altro specchio da due pollici sul bordo opposto della tavola ottica per deviare il fascio ad un angolo di 90 gradi e utilizzare le viti di regolazione per fissarlo in posizione. Successivamente, posizionare due iridi e regolare i due specchi come in precedenza per centrare il fascio. Quindi posizionare l'obiettivo di scansione alla sua distanza focale dal galvanometro lungo il percorso del fascio e regolarne la posizione orizzontale e verticale.

Per centrare il punto laser sulla prima iride tra i due specchi. Posizionare con attenzione la grande lente tubolare da due pollici alla distanza appropriata rispetto alla lente di scansa e regolarne la posizione orizzontale e verticale per centrare il fascio sulla prima iride. In questo apparato, la lente tubolare viene posizionata a una distanza di 75 millimetri più 300 millimetri con tutti i componenti al loro posto.

Collegare il galvanometro O all'uscita di un generatore di funzioni elettrico standard o di un circuito di controllo e impostare le tensioni da picco a picco da uno a tre volt. Quindi iniziare a scansionare i due specchi utilizzando una scheda di presentazione. Individuare il fascio laser sul piano stazionario, a 300 millimetri dopo la lente tubolare.

Posizionare l'obiettivo nel percorso del fascio, assicurandosi di avvicinare l'apertura posteriore dell'obiettivo al piano stazionario il più possibile. Configurare la piattaforma del campione, verificando che il supporto traslabile sull'asse Z non urti contro il supporto dell'obiettivo durante lo spostamento nell'intero suo intervallo. Per configurare il confocale, iniziare scollegando tutti gli alimentatori e le fibre ottiche dal diaframma e dal rivelatore.

Ruotare l'assiemblea del microscopio in modo che riposi nuovamente sulla breadboard, tenendo lo specchio risonante di scansione. Dopo aver ricollegato la fibra al collimatore e allo specchio standard di scansione, ai cavi di alimentazione e di controllo, applicare zero volt sulla tensione di controllo che guida il galvanometro standard di scansione come in precedenza sullo stage; posizionare un campione di un colorante brillante incapsulato tra due coprioggetti. Quindi accendere la sorgente laser e mettere a fuoco il colorante.

Regolare la potenza del laser per rendere la fluorescenza il più intensa possibile utilizzando un biglietto da visita. Seguire l'emissione fluorescente dal campione attraverso l'obiettivo, il sistema di scansione fino allo specchio dicromatico, che riflette il fascio laser e trasmette l'emissione fluorescente. Individuare questo segnale fluorescente sull'altro lato dello specchio dicromatico.

Ora attenuare le luci della stanza. Posizionare uno specchio dietro lo specchio dicotico per riflettere l'emissione ad un angolo di 90 gradi. Quindi, utilizzando un diaframma con uno specchio, indirizzare il fascio di fluorescenza il più possibile dritto e parallelo alla basetta.

Successivamente, l'unità dello stenopeo confocale verrà configurata utilizzando l'assiemaggio del supporto a gabbia con filtro spaziale di Thor Labs. Questo diagramma illustra la configurazione. Lo specchio di scansione si trova su piani stazionari che sono in relazione teleobiettiva con un obiettivo stazionario.

Coppie di lenti tra piani stazionari nel piano dell'apertura posteriore agiscono per inviare i fasci scansionati. La prima coppia di lenti ha lunghezze focali uguali, formando un telescopio uno a uno. La seconda coppia di lenti, nota formalmente come lente di scansionamento e lente del tubo, non deve avere lunghezze focali uguali e spesso funge da telescopio espansore del fascio per garantire che l'apertura posteriore dell'obiettivo sia sovralimentata.

La luce emessa dal campione viaggia nuovamente attraverso il sistema di scansione e viene fatta passare attraverso lo specchio dicromatico. Una lente con corta distanza focale o una lente obiettivo focalizza la luce emessa attraverso il pinhole confocale, che viene quindi collimata da una lente. Una lente finale focalizza l'emissione filtrata in modo confocale su un fotomoltiplicatore.

Posizionare l'unità di filtraggio spaziale lungo il percorso del fascio emesso, avendo cura di centrare il supporto della prima lente di focalizzazione sul fascio emesso. In questo caso, è stata selezionata un'unità di filtraggio spaziale con un foro di 100 micron. Successivamente, montare una lente con breve distanza focale nell'unità e spostare il supporto di traslazione lungo l'asse Z finché non si osserva un fuoco nitido sulla superficie del foro.

Assicurarsi che l'intera unità sia orientata lungo la linea retta definita dal fascio fluorescente. Fissare l'unità al breadboard. Ora, utilizzando le manopole di regolazione della fase di traslazione, regolare i due assi per eseguire una ricerca bidimensionale sulla superficie del supporto del diaframma, al fine di individuare il punto in cui il segnale fluorescente trasmesso attraverso il diaframma è massimizzato.

Successivamente, posizionare l'obiettivo di rivestimento sul supporto a gabbia. Dopo il foro stenopeico, utilizzando una scheda di presentazione, individuare il fascio fluorescente che attraversa l'unità confocale e spostare l'obiettivo di rivestimento lungo i supporti finché la fluorescenza emessa non risulti il più possibile collimata. Configurare l'assiemaggio del tubo fotomoltiplicatore. Posizionare una lente con lunghezza focale di 50 millimetri nel percorso del fascio di emissione fluorescente e individuarne il punto focale.

Segnare questa posizione sulla basetta sperimentale. Spegnere ora completamente il laser e posizionare il tubo fotomoltiplicatore in modo che la sua finestra sia il più vicino possibile al punto focale segnato. Quindi, utilizzando tubi regolabili per lenti, collegare l'insieme alla lente di focalizzazione.

Avvolgere del nastro scuro intorno a tutti i percorsi del fascio esposti dopo il foro stenopeico, accendere il laser mantenendone la potenza estremamente bassa. Accendere il tubo fotomoltiplicatore leggendo attentamente la sua tensione sull'oscilloscopio. Aumentando l'intensità del laser, aumentare la tensione finché non si osserva un segnale a picco e/o un offset in corrente continua sullo schermo dell'oscilloscopio.

Verificare che questo segnale derivi effettivamente dalla fluorescenza spegnendo la potenza del laser o bloccando il percorso del fascio per osservare la perdita del segnale. Infine, allineare in modo iterativo il diaframma per ottenere il segnale massimo sull'oscilloscopio. Manipolando prima la posizione Z della lente di focalizzazione e poi regolando lo stadio di traslazione YZ, l'hardware del microscopio a velocità video è completo.

Per prima cosa, spegnere il tubo fotomoltiplicatore. Ora collegare i circuiti di controllo personalizzati per gli specchi e il computer come illustrato nel protocollo scritto allegato. Questo sistema può essere adattato per eseguire microendoscopia a scansione confocale.

Sostituendo il supporto con un supporto per fibra, si prega di consultare il testo allegato o i dettagli. Il microscopio confocale a scansione eretto finito e il microendoscopio dovrebbero apparire come mostrato qui. I fasci laser e di emissione sono stati disegnati come guida per l'occhio.

Durante il funzionamento della microendoscopia, un supporto per fibra tiene ferma la fibra immagine durante gli esperimenti. Questo supporto per fibra può essere facilmente sostituito con un palco XY per utilizzi diversi. Una piattaforma di microscopio diritto mostrata qui è un'immagine rappresentativa ottenuta dalla lettera minuscola M stampata su un biglietto da visita bianco, utilizzando una scheda acquisizione frame a velocità video per generare immagini dal segnale in ingresso. Sbiancato.

Il foglio bianco contiene fluorofori che vengono facilmente eccitati dalla luce UV e blu, producendo uno sfondo luminoso dietro la zona scura. La lettera M e un filtro di emissione centrato a 515 nanometri sono stati scelti per raccogliere questa emissione fluorescente. È possibile osservare una lieve distorsione dell'immagine, specialmente nelle zone vicine ai bordi laterali del fotogramma.

Questa distorsione è causata dal pattern di scansione sinusoidale dello specchio gvo a otto chilohertz ed è descritta in dettaglio nel documento allegato. Questo filmato mostra dati a velocità video ottenuti scansionando un biglietto da visita. Dopo aver visto questo video, ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire e allineare un microscopio confocale a scansione con velocità video.

Non dimenticare che lavorare con la luce laser può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come rimuovere tutti i gioielli riflettenti ed evitare di lavorare con gli occhi all'altezza del percorso del fascio devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.