Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti

Gli obiettivi generali dei seguenti esperimenti sono comprendere le proprietà delle membrane eccitabili e la base ionica del potenziale di membrana a riposo, nonché apprendere metodi per misurare il potenziale di membrana e dimostrare le proprietà della trasmissione sinaptica. In una parte dell'esperimento, il potenziale di membrana a riposo verrà misurato modificando la concentrazione di potassio extracellulare. In un'altra parte dell'esperimento, i meccanismi della differenziazione sinaptica saranno studiati registrando risposte sinaptiche evocate in diverse unità motorie.

Successivamente, viene presentato un circuito neurale facile da mantenere. Questo preparato può essere utilizzato sia per scopi didattici che per lo studio di vari aspetti di un circuito sensoriale verso il sistema nervoso centrale, dai neuroni motori ai muscoli. Questa serie di esperimenti dimostra la facilità di utilizzo del modello di gambero per affrontare questioni relative all'integrazione e alla trasmissione sinaptica del potenziale di membrana e alle differenze strutturali dei tipi di fibre muscolari.

I principali vantaggi dell'utilizzo del preparato di gambero nell'insegnamento dei concetti e delle tecniche elettrofisiologici sono la facilità di dissezione, la capacità del preparato di rimanere vitale in una soluzione salina minima, la facilità di ottenere risposte sinaptiche e la semplicità nel distinguere l'organizzazione anatomica complessiva dei muscoli. Queste tecniche possono essere applicate anche ad altri preparati e contribuiranno a migliorare la comprensione della fisiologia e della modulazione sinaptica, nonché delle differenze biochimiche e strutturali nel preparato dimostrato. Per iniziare l'intervento chirurgico, selezionare un gambero di circa sei-dieci centimetri di lunghezza corporea e posizionarlo in ghiaccio tritato per cinque minuti per anestetizzarlo; per decapitare il gambero, afferrarlo dalla parte posteriore della testa, assicurandosi di tenere le dita lontane dalle chele e dalla bocca dell'animale, utilizzando forbici grandi.

Rimuovere rapidamente la testa effettuando un taglio netto dietro gli occhi dell'astice d'acqua dolce, quindi rimuovere le zampe e le chele per evitare lesioni. Rimuovere gli stili nei maschi e le natatoie sia nei maschi che nelle femmine. Smaltire la testa e gli arti.

Successivamente, separare l'addome dal torace effettuando un taglio lungo la membrana articolare che unisce addome e torace. Conservare la porzione addominale dell'astice e scartare il torace; orientando leggermente verso il basso, in direzione del lato ventrale e con un angolo, effettuare un taglio nel carapace lungo il margine laterale inferiore di ciascun lato dell'addome. Prestare attenzione a non tagliare troppo in profondità all'interno dell'astice.

Seguire il disegno naturale delle linee del carapace dell'astice, che si estendono lungo la lunghezza di ogni segmento, utilizzando una pinzetta. Rimuovere la porzione ventrale del carapace tirandola verso l'alto e all'indietro, avendo cura di non danneggiare i muscoli addominali.

Rimuovere i muscoli flessori. A questo punto, una massa bianca di tessuto può essere vista sopra i muscoli flessori profondi. Rimuovere con cura questo tessuto utilizzando pinzette.

L'apparato digerente è ora visibile come un piccolo tubo che corre lungo la linea mediana dei muscoli flessori profondi. Rimuoverlo pinzandolo con una pinzetta nella parte superiore e tirandolo via dall'addome. Tagliare la parte inferiore dell'apparato digerente all'estremità della coda.

Risciacquare la dissezione con soluzione fisiologica per assicurarsi che i residui fecali non interferiscano con il preparato. Utilizzando perni da dissezione, fissare gli angoli superiore e inferiore del preparato a una piastra di Petri rivestita con S guard. I muscoli estensori addominali sono ora esposti.

Versare soluzione salina nella piastra di Petri in modo da coprire il preparato fino all'esecuzione delle registrazioni intracellulari. Spostare la piastra di Petri sul microscopio e utilizzare della cera sotto la piastra per impedirne lo spostamento. L'apparato utilizzato per le registrazioni intracellulari è mostrato in questa figura.

I collegamenti e le impostazioni appropriati sono indicati nel testo allegato. Configurare il software della scheda di laboratorio seguendo le istruzioni. Nel testo allegato, posizionare il cavo di messa a terra nel bagno salino.

Posizionare la punta di una micropipetta di vetro riempita con cloruro di potassio tre molare nel bagno salino e verificare la resistenza dell'elettrodo. La resistenza dell'elettrodo deve essere compresa tra 20 e 60 megaohm. Utilizzare la manopola grossolana dell'amplificatore per spostare la linea sul diagramma del laboratorio a zero sotto un'illuminazione intensa.

Esaminare al microscopio e identificare i muscoli DEM longitudinali. Utilizzare la sonda elettrodica per inserire l'elettrodo intracellulare in una fibra muscolare del muscolo DEM. L'elettrodo deve essere inserito appena appena nella fibra muscolare.

Attenzione a non penetrare completamente la cellula. Misurare l'ampiezza del potenziale di riposo. Trascinare il cursore M sul tracciato a partire dalla posizione situata nell'angolo in basso a sinistra della finestra del grafico.

Posizionare il marcatore M sulla linea di base e spostare il cursore sul punto più basso del segnale registrato. La differenza tra il marcatore e il cursore attivo viene visualizzata nell'angolo superiore destro dello schermo. Questo valore corrisponde al voltaggio del potenziale di membrana a riposo.

Dividere la tensione registrata per il fattore di amplificazione; in questo caso è stato utilizzato un'amplificazione 10x. Successivamente, convertire la tensione da volt a millivolt. Dopo aver registrato il potenziale di riposo per quella fibra muscolare, osservare attraverso il microscopio e rimuovere con attenzione l'elettrodo dalla fibra muscolare.

Ripetere la registrazione intracellulare su altre fibre muscolari. La parte successiva di questo esperimento monitorerà l'effetto dell'aumento della concentrazione di potassio extracellulare sul potenziale di membrana a riposo. Saranno utilizzate sei soluzioni saline per gambero con concentrazioni di potassio pari a 5,4, 20, 40, 60, 80 e 100 millimolari.

Scegliere un muscolo che non stia fremendo per effettuare la successiva registrazione intracellulare tra una registrazione e l'altra. Sostituire la soluzione nel bagno con la soluzione successiva di cloruro di potassio a concentrazione più elevata. Assicurarsi di coprire completamente il preparato ogni volta.

Registrare le variazioni del potenziale di membrana per ogni soluzione. L'effetto dell'aumento della concentrazione extracellulare di potassio sul potenziale di membrana è mostrato in questo grafico, in cui i potenziali di membrana a riposo per ciascuna concentrazione di potassio sono riportati in un grafico semilogaritmico della concentrazione extracellulare di potassio in funzione del potenziale di membrana. Allineare il potenziale di riposo a una concentrazione extracellulare di potassio di 5,4 millimolare.

Per le curve ipotetiche e osservate, confrontare la pendenza della linea osservata con quella della linea ipotetica. Al termine di queste registrazioni elettrofisiologiche, il passo successivo consiste nell'esaminare l'anatomia delle fibre muscolari e il loro schema di innervazione. Trasferire il preparato nella bacinella in piedi e aggiungere blu di metilene.

Dopo cinque minuti, rimuovere il blu di metilene e aggiungere soluzione salina fresca per gamberi. Individuare il nervo principale che innerva i muscoli all'interno di un segmento. Disegnare lo schema di innervazione dei muscoli S-E-M-D-E-L 2D EL uno e DEM in un segmento.

Successivamente, spostare il preparato sotto una cappa aspirante. Rimuovere la soluzione salina e aggiungere il fissativo. Il fissativo utilizzato qui è una soluzione poin.

Lo scopo della cappa chimica è evitare i vapori del fissativo. Prestare molta attenzione a non far entrare la soluzione a contatto con la pelle o gli occhi. Se gli occhi iniziano a bruciare, lavarli immediatamente alla stazione per il lavaggio degli occhi.

Lasciare la soluzione boina in contatto con il preparato per circa 10 minuti, quindi utilizzare una pipetta per sostituire la soluzione con soluzione fisiologica. Ritagliare un sottile segmento del muscolo DEL uno o DEL due. Posizionarlo su un vetrino.

Etichettare il vetrino. Ripetere la procedura per il muscolo SEM. Utilizzare il microscopio ottico per osservare il modello di striature dei sarcomeri in entrambi i preparati tessutali.

La prossima serie di esperimenti esaminerà come registrare le risposte sinaptiche nei muscoli addominali del gambero. Selezionare un altro gambero e decapitarlo. Rimuovere il torace e gli ap pendici ed esporre i muscoli estensori addominali come mostrato nell'intervento chirurgico.

Nella prima sezione di questo video, utilizzando il microscopio, individuare il nervo che trasporta gli assoni motori ai muscoli estensori. Cercare il segmento con il nervo più accessibile. Il nervo è di colore bianco e può essere osservato spruzzando salina sulla preparazione con una pipetta o soffiando leggermente sulla preparazione.

Questo provoca lo spostamento del nervo, rendendone così l'identificazione più semplice. Posizionare l'elettrodo di aspirazione, tenuto dal micromanipolatore, direttamente sopra il nervo. Tirare delicatamente sulla siringa per aspirare il nervo all'interno dell'elettrodo.

È possibile osservare il nervo che viene aspirato all'interno dell'elettrodo attraverso il microscopio. Regolare le impostazioni nel software della scheda di acquisizione dati come specificato nell'articolo allegato. Riempire un microelettrodo di vetro con cloruro di potassio tre molare e collegarlo allo stadio di testa e al power lab.

Utilizzare la manopola grossolana sull'amplificatore per spostare la linea del grafico del laboratorio su zero. Prima di inserire l'elettrodo, il pulsante a levetta deve essere acceso e spento più volte. Per verificare la resistenza dell'elettrodo, misurare l'ampiezza dei valori risultanti.

Osservare attraverso il microscopio e utilizzare la sonda dell'elettrodo per inserire l'elettrodo in una delle fibre muscolari longitudinali, sia quella DEM, che DL uno o DL due. Fare attenzione a non penetrare completamente la fibra muscolare. Il preparato è ora pronto per l'esperimento.

L'elettrodo di aspirazione viene utilizzato per stimolare il fascio nervoso segmentale e l'elettrodo microscopico di vetro viene utilizzato per registrare la risposta sinaptica dalla fibra muscolare, attivando lo stimolatore del trapianto per stimolare il nervo a un hertz per ottenere risposte fasiche. Successivamente, posizionare l'elettrodo in una fibra muscolare SEL. Il SEL è un muscolo tonico.

Stimolare il nervo con brevi raffiche di impulsi a 10 hertz per ottenere risposte toniche. Confrontare le risposte registrate dei muscoli DEL e SEL. Notare che i muscoli fasici DEL presentano risposte sinaptiche di ampiezza maggiore rispetto ai muscoli tonici SEL.

Questo successivo insieme di esperimenti si concentra sui muscoli flessori dell'astice piuttosto che sui muscoli estensori. Partendo da un nuovo astice, isolare l'addome come mostrato in questo intervento chirurgico. Nella prima sezione di questo video, posizionare il preparato della coda isolata in una capsula di Petri riempita di soluzione salina, fissare con spilli la coda e la porzione superiore del preparato.

Si noti che negli esperimenti di decarizzazione sui muscoli flessori tonici, il cordone nervoso ventrale deve essere lasciato integro. Utilizzare un bisturi per iniziare un taglio longitudinale attraverso la membrana articolare tra due coste sul lato ventrale del preparato. Prestare molta attenzione a non tagliare troppo in profondità durante questo intervento, poiché un taglio profondo potrebbe recidere la radice del nervo motore, con l'obiettivo di garantire che i muscoli superficiali non vengano danneggiati.

Eseguire il passaggio successivo. Guardando attraverso un microscopio, utilizzare forbici o un bisturi per effettuare un taglio orizzontale a partire dall'incisione longitudinale nel sottile strato membranoso che ricopre il muscolo. Allargare il taglio per creare una linguetta di membrana articolare e sollevare la linguetta verso l'alto.

Usare le forbici per tagliare la falda esponendo i muscoli flessori superficiali al fine di effettuare la registrazione intracellulare dai muscoli flessori superficiali. Utilizzare la stessa strumentazione e configurazione impiegate per registrare il potenziale di membrana a riposo e le risposte sinaptiche dai flessori addominali. Come in precedenza, usare un elettrodo intracellulare riempito con cloruro di potassio tre molare.

Inserire l'elettrodo in una fibra muscolare dei muscoli flessori superficiali, avendo cura di non attraversare completamente il muscolo. Registrare l'attività spontanea dei PEPS. Osservare le diverse ampiezze dei PEPS e verificare la presenza di qualsiasi PISP.

Prendere un piccolo pennello e spazzolare con attenzione lungo il margine della cuticola all'interno del segmento contenente l'elettrodo di registrazione. Osservare eventuali variazioni nella frequenza o nell'ampiezza dei potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) in seguito alla stimolazione, qualora si osservi una risposta maggiore. Ciò indicherebbe il reclutamento di ulteriori motoneuroni che rispondono al cambiamento nell'attività di scarica del nervo sensitivo.

Sostituire con attenzione la soluzione salina del bagno con una contenente un neuromodulatore, come un micromolare di serotonina o salina saturata con anidride carbonica. Ripetere quindi la stimolazione con il pennello. Osservare l'effetto che la modifica della soluzione del bagno ha sull'attività registrata.

Ripristinare la soluzione fisiologica normale nel bagno e osservare il ritorno dell'attività della fibra muscolare ai livelli di base. Questa figura mostra i potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) registrati in una fibra muscolare flessoria superficiale. Notare le diverse ampiezze degli EPSP.

La fase successiva di questo esperimento utilizza un elettrodo extracellulare per monitorare i potenziali d'azione dei neuroni motori in risposta all'attività del circuito da nervi sensitivi al SNC fino ai neuroni motori. Iniziare realizzando un elettrodo a succhietto per stimolare i nervi sensitivi. Tirare un pezzo di tubo di plastica sopra una fiamma.

Il passaggio successivo consiste nel tagliare il tubo alla dimensione desiderata. Per farlo, è necessario osservare il nervo nel proprio preparato per valutare il diametro di apertura desiderato per l'elettrodo a suggente. A seconda delle dimensioni dell'astice, i fasci nervosi possono variare di dimensione da circa un millimetro fino a pochi millimetri di diametro.

Tagliare la sezione di tubo allungata per ottenere un'apertura alla punta delle dimensioni corrette per contenere il nervo. Se l'apertura è troppo grande, il nervo potrebbe uscire. Se l'apertura è troppo piccola, il nervo potrebbe subire danni a causa della pressione dell'elettrodo.

Posizionare il tubo di plastica sulla punta di un elettrodo suc in vetro. L'allestimento per elettrofisiologia e software è leggermente diverso rispetto al monitoraggio delle risposte extracellulari, rispetto a quello utilizzato per le registrazioni intracellulari. Utilizzando l'apparecchiatura specificata nell'articolo associato, aspirare la terza radice che innerva il muscolo flessore superficiale all'interno dell'elettrodo a suggizione.

Ora puoi iniziare a registrare i potenziali d'azione. Questo percorso comprende cinque neuroni motori eccitatori e un neurone motore inibitore. Dopo aver registrato l'attività di base, stimola la cuticola con un pennello per osservare il cambiamento nei potenziali d'azione generati.

In seguito, sostituire la soluzione di bagnatura con neuromodulatori come la serotonina, come nell'esperimento precedente, e registrare qualsiasi variazione nella risposta. Ulteriori esercizi sono riportati nel testo allegato. Questa registrazione mostra i potenziali d'azione registrati dal terzo assone prima e durante la stimolazione della cuticola con un pennello; confrontare la frequenza dei potenziali d'azione prima dello stimolo con quella durante la stimolazione.

Questa registrazione mostra i potenziali d'azione registrati dal terzo nervo in soluzione salina normale e in una soluzione di serotonina. Confronta la frequenza dei potenziali d'azione in soluzione salina normale con la loro frequenza in serotonina, come mostrato poco fa. La stimolazione aumenta la frequenza di scarica rispetto al valore basale.

È inoltre dimostrato che la serotonina aumenta la frequenza di scarica rispetto alla soluzione salina normale. Questa figura mostra che quando la stimolazione meccanica e la serotonina vengono combinate, si osserva un ulteriore aumento della frequenza di scarica. Il confronto tra gli effetti esterni e quelli teorici della concentrazione esterna di potassio sul potenziale di membrana a riposo indica l'influenza degli ioni sul potenziale di membrana.

Abbiamo inoltre mostrato come registrare le risposte ntic alle giunzioni neuromuscolari di muscoli sia fasici che tonici. Queste tecniche possono essere utilizzate in laboratori sperimentali per studenti al fine di insegnare concetti fondamentali e principi di fisiologia. Le tecniche acquisite in questo esercizio di laboratorio possono essere impiegate per rispondere a domande relative ad altre preparazioni sperimentali, nonché ad applicazioni fisiologiche connesse alla medicina e alla salute.