La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di costituire uno strumento didattico per studenti di scuola superiore avanzata e universitari dei corsi di fisiologia che partecipano a esperimenti fisiologici. Gli studenti imparano a esporre e registrare le contrazioni nell'intestino posteriore del gambero. Un ulteriore passaggio consiste nell'escindere l'intestino posteriore dall'animale, il che permette l'applicazione diretta di composti.

Successivamente, la forza e il ritmo delle contrazioni del muscolo liscio dell'intestino posteriore vengono monitorati applicando diversi agenti farmacologici per esaminare i meccanismi che alterano l'intensità della contrazione. Si ottengono risultati che mostrano l'azione dei modulatori sulle innervazioni neurali o direttamente sul muscolo, in base a saggi farmacologici e sottotipizzazione dei recettori. Salve, sono il dottor J. Mercier del Dipartimento di Scienze Biologiche della Brock University.

Ho utilizzato l'intestino posteriore del gambero come preparazione per condurre ricerche sui neurotrasmettitori che controllano i muscoli viscerali. Ho inoltre impiegato questa preparazione come strumento didattico e, nell'ambito di una collaborazione con il laboratorio del Dott. Robin Cooper presso l'Università del Kentucky, stiamo perfezionando diversi esperimenti eseguiti dagli studenti a scopo formativo. Questo metodo può fornire informazioni sul funzionamento dell'intestino posteriore del gambero.

È inoltre applicabile negli studi di patologie come quelle che coinvolgono i ritmi peristaltici. Può essere utilizzato anche per descrivere i meccanismi alla base della modulazione dell'innervazione muscolare e nervosa. Gli studenti impareranno a interpretare dati fisiologici e farmacologici attraverso l'uso di agenti farmacologici, neurotrasmettitori e neuroormoni, e acquisiranno una comprensione generale della funzione recettoriale.

Per quanto riguarda agonisti e antagonisti, gli studenti costruiranno curve dose-risposta e presenteranno i dati in forma grafica per l'analisi statistica. Per anestetizzare l'animale, posizionare un gambero di lunghezza corporea compresa tra sei e dieci centimetri su del ghiaccio per cinque-dieci minuti. Tenere il gambero anestetizzato dietro le chele con una mano. Tagliare rapidamente dall'orbita oculare fino al centro della testa su entrambi i lati, quindi staccare la testa dal gambero.

Il sangue della preparazione sarà appiccicoso durante la manipolazione, quindi lavare gli strumenti al termine. Successivamente, rimuovere le zampe e le chele. Poi tagliare le pinne laterali della coda, lasciando intatta la pinna centrale, e proseguire il taglio lungo il lato dorsale dell'addome fino all'ultimo segmento.

Quindi tagliare lungo l'ultimo segmento e lungo l'altro lato. Rimuovere il carapace dorsale. Posizionare l'astice dissecato nella capsula di Petri foderata con carta da sigaretta.

Soluzione salina scarsa per gamberi. Per coprire il preparato, utilizzare puntine da dissezione per fissare il preparato alla capsula di Petri. L'intestino posteriore è solitamente circondato da una massa di vasi sanguigni e tessuto connettivo.

Rimuoverli con pinzette, avendo cura di non danneggiare l'intestino. L'intestino posteriore è ora visibile lungo l'addome.

Lasciare il preparato di gambero dissecato in soluzione salina per circa 10 minuti, in modo che possa riprendersi dallo shock della dissezione e dall'esposizione alla soluzione salina. Osservare le lente contrazioni peristaltiche dell'intestino posteriore. A questo punto, è possibile calcolare la frequenza delle contrazioni.

Contare il numero di contrazioni che si verificano in 30 secondi e registrarle in un registro. Registrare anche il tipo di contrazioni che si verificano e se sono peristaltiche o spastiche. Notare la direzione di eventuali onde peristaltiche.

Contare la frequenza delle contrazioni vicino all'ano e a metà dell'addome, verificare se esistono differenze di frequenza tra queste due regioni. Avere a disposizione una varietà di soluzioni di prova pronte e alla stessa temperatura della soluzione salina di immersione. La prima soluzione testata qui sarà serotonina uno micromolare preparata in soluzione salina per gamberi di fiume.

Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione salina dalla cavità dell'addome esposto dell'astice e applicare direttamente la soluzione di serotonina da un micromolare sul retto. Immediatamente dopo aver aggiunto la nuova soluzione, attendere 30 secondi e quindi contare le contrazioni avvenute nell'arco di 30 secondi nella zona vicina all'ano, dopodiché contare le contrazioni dei successivi 30 secondi a metà dell'addome. Registrare questi valori in una tabella e annotare anche il tipo di contrazioni che si verificano. Successivo.

Versare la soluzione di prova dalla capsula di registrazione e risciacquare l'intestino posteriore diverse volte con soluzione fisiologica normale per gamberi. Quindi risciacquare il preparato ogni 30 secondi per cinque minuti. A questo punto, è possibile aggiungere la successiva soluzione di prova, che in questa dimostrazione è una micromolare di Topamina.

Registri le osservazioni come in precedenza e ripeta questo processo per i restanti composti in esame. Quando si utilizzano concentrazioni multiple della stessa sostanza, assicurarsi di iniziare dalla concentrazione più bassa e procedere verso concentrazioni più elevate. L'allestimento per misurare la forza delle contrazioni GI comprende un laptop con il software Lab Chart 7, il Bridge Pod, il Power Lab 26T e il trasduttore di forza.

Prima di poter misurare la forza delle contrazioni muscolari del tratto gastrointestinale, è necessario isolare il tratto GI. A tale scopo, asportare i muscoli nell'ultimo segmento addominale, inserire due o più spilli attraverso la cuticola ventrale morbida su entrambi i lati dell'ano, quindi rimuovere il resto dell'addome, lasciando il retto e l'ano attaccati a un piccolo frammento di cuticola. L'intestino deve essere sezionato vicino alla giunzione tra torace e addome.

Ora spostare il tratto gastrointestinale in una piastra bassa con fondo rivestito in sardina. Lungo l'aspetto dorsale del tratto gastrointestinale si trova un vaso sanguigno. Rimuoverlo con attenzione dal tratto gastrointestinale.

Versare una soluzione salina fresca per gamberi sulla preparazione. Spostare il trasduttore di forza sulla preparazione. Osservare attentamente il perno incollato alla base del trasduttore di forza.

La punta che si aggancia all'intestino presenta una piccola curvatura. Agganciare la piccola curvatura del perno all'estremità tagliata dell'intestino posteriore. Dopo aver agganciato l'intestino posteriore, spostare leggermente la piastra finché l'intestino posteriore non risulta teso.

Siate cauti in questo passaggio poiché l'intestino deve essere teso, ma non troppo. Se troppo teso potrebbe danneggiare il muscolo. Quando la piastra è nella posizione ottimale, utilizzate cera o argilla per mantenerla ferma.

Successivamente, avviare il software. Per iniziare la registrazione, aprire il software Lab Chart. Chiudere il Lab Chart e il Welcome Center.

Vai alla configurazione in alto a sinistra. Fai clic su impostazioni del canale in basso a sinistra. Modifica le impostazioni del canale in modo da avere un solo canale.

Fare clic su ok nella parte destra dello schermo. Passare al canale uno, aprire il modulo bridge. Impostare la scala sull'impostazione più sensibile, in questo caso 200 microvolt, nella parte superiore del grafico nell'angolo destro.

Impostare i cicli al secondo su 2K. Ora sei pronto per registrare. Fare clic su inizia per assicurarsi che l'installazione funzioni correttamente.

Toccare leggermente la punta del trasduttore con una pipetta. Si dovrebbe osservare una variazione della forza registrata dal software. Fare clic su stop nel software, quindi su start e lasciare eseguire il programma.

Per circa 20 secondi, fare clic su stop e aggiungere un commento etichettato come soluzione salina. Calcolare la frequenza delle contrazioni misurando il tempo che intercorre dall'inizio di una deflessione all'inizio della successiva, oppure contando il numero totale di deflessioni in un minuto o due. Calcolare la frequenza in contrazioni al minuto o in contrazioni al secondo, a seconda della rapidità con cui si verificano.

Per misurare la forza delle contrazioni, utilizzare una misura relativa per confrontare le contrazioni in diverse condizioni sul file salvato. Spostare il marcatore M alla linea di base, quindi spostare il cursore fino al picco della deflessione e annotare il valore indicato in alto a destra dello schermo. Questo è un valore delta, ovvero la differenza tra M e il picco.

Si noti che il cursore deve essere mantenuto fermo sul picco al fine di misurare la variazione. Successivamente, spostare il marcatore M e il cursore sulla successiva forma d'onda di interesse e ripetere la misurazione per esaminare l'effetto dei modulatori. In questo preparato, passare lentamente alla soluzione di prova.

In questo caso, aggiungere un micromolare di serotonina e continuare a registrare la frequenza e la forza delle contrazioni come ultimo test. Per questo preparato, verificare se gli inibitori delle giunzioni comunicanti modificano la frequenza o la forza delle contrazioni; gli inibitori delle giunzioni comunicanti includono etanolo eparinizzato o soluzione salina saturata con anidride carbonica. Questi composti vengono utilizzati per ultimi poiché potrebbero danneggiare le fibre muscolari dopo un'esposizione prolungata. Per confrontare l'effetto dei vari composti, riportare i dati in un grafico.

Un altro interessante utilizzo di questa preparazione consiste nel registrare la forza generata dai muscoli circolari. Tuttavia, se si sono applicati inibitori delle giunzioni comunicanti alla preparazione, questi potrebbero aver danneggiato i muscoli circolari; in tal caso, si dovrebbe utilizzare una preparazione fresca dell'intestino posteriore per testare i muscoli circolari. Per esporre i muscoli circolari, praticare un'incisione longitudinale lungo il tubo intestinale con forbici fini.

Utilizzare spilli fini per fissare saldamente un lato alla piastra. Collegare lo spillo ad uncino del trasduttore all'altro lato della striscia. Esporre il preparato agli stessi composti testati sui muscoli longitudinali; la relazione tra i composti testati e il numero e tipo di contrazioni è mostrata qui.

È possibile tracciare graficamente il numero di contrazioni in funzione del tempo per le soluzioni di soluzione fisiologica, serotonina e glutammato. È possibile riportare graficamente il numero di contrazioni in funzione della forza delle contrazioni in millivolt per le soluzioni di soluzione fisiologica, serotonina e glutammato. Questi grafici possono essere realizzati sia per i muscoli longitudinali che per quelli circolari, al fine di verificare se i muscoli longitudinali e circolari nelle diverse regioni dell'intestino presentano risposte differenti ai vari modulatori.

Gli esperimenti sopra descritti possono essere ripetuti su diverse regioni a partire dall'ano e lungo l'addome. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a non danneggiare il tratto gastrointestinale con le pinzette e di non tirare troppo forte con il trasduttore di forza dopo aver eseguito questa procedura. Altri metodi, come le registrazioni elettrofisiologiche del muscolo, possono essere effettuati per affrontare altri aspetti, quali le funzioni e le modulazioni dei canali ionici, e possono servire come modello per altri tessuti in altri modelli animali.