Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività postsinaptica a livello delle sinapsi afferenti delle cellule ciliate interne. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto l'epitelio sensoriale di una coclea recentemente rimossa da un ratto decapitato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel posizionare l'apice escisso su un cover slip modificato e trasferirlo nella camera di registrazione.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel localizzare e accedere a un bastoncello afferente mediante un elettrodo di registrazione. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel formare un sigillo stretto sulla membrana della fibra afferente e successivamente romperla, stabilendo la configurazione a intera cellula della tecnica del patch clamp. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'insorgenza o i potenziali post-sinaptici da una singola sinapsi a nastro mediante elettrofisiologia in configurazione a intera cellula con la tecnica del patch clamp.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione e la preparazione del tessuto cocleare sono difficili da apprendere e le piccole fibre afferenti sono difficili da riconoscere e raggiungere. Prima di iniziare la dissezione, preparare un'ansa modificata in vetro che manterrà la preparazione in posizione durante le registrazioni. Utilizzando un'ansa circolare in vetro di otto-dodici millimetri, applicare una goccia di Sylgard parzialmente polimerizzato verso il bordo dell'ansa.

Posizionare l'estremità spessa di un ago sottile per insetti sul vetrino. Tenere saldamente l'ago contro il vetro. Con una pinzetta, riscaldare il bordo di tenuta contro una spirale riscaldata per fissarlo.

Preparare da 10 a 20 microelettrodi come descritto nel testo allegato. Dopo la lucidatura a fiamma con un microforno, il microelettrodo dovrebbe avere un diametro esterno della punta di circa un micron. Lo spessore finale della parete della pipetta è pari a circa un terzo di micrometro dopo l'anestesia e la decapitazione di un ratto di tre settimane di età.

Iniziare la dissezione rimuovendo la pelle sezionando la testa ed estraendo il cervello. Per esporre l'osso temporale, rimuovere entrambi gli ossi temporali. Posizionare ciascun osso temporale in una bacinella da dissezione pulita contenente soluzione extracellulare standard. Il passaggio successivo consiste nel rimuovere l'osso che racchiude l'osso temporale, al fine di esporre la coclea.

Tenere saldamente l'osso temporale alla base con una pinzetta. Individuare la finestra rotonda, la finestra ovale e la coclea. Orientare la coclea in modo che la finestra ovale e il lato spirale della coclea siano rivolti verso l'alto.

Rimuovere l'eccesso di osso intorno al coclea. Utilizzare una seconda coppia di pinzette fini per staccare l'osso direttamente dal coclea, iniziando dall'area più trasparente rispetto al resto dell'osso. In questa zona l'osso è più sottile e più facile da rimuovere.

Continuare a rimuovere l'osso intorno alla spirale apicale. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare il modiolo al di sotto del giro apicale. Successivamente, staccare il giro apicale dai giri inferiori della coclea.

Prestare attenzione a proteggere la spirale apicale. Non deve essere tirata né stirata. Infine, rimuovere il giro apicale dalla coclea senza strappare eccessivamente il tessuto.

Utilizzare pinzette fini per rimuovere il resto dell'osso. Il passaggio successivo consiste nel rimuovere la STR degli oculi e la membrana tiale. Rimuovere con attenzione la STR degli oculi, la striscia lucida di tessuto situata all'esterno della regione delle cellule ciliate.

Assicurarsi di evitare la rimozione delle cellule ciliate sensoriali, che possono facilmente staccarsi insieme alla STR di oculis. Successivamente, utilizzare pinzette fini per staccare la membrana tiale. La membrana lucente e semitrasparente che si trova sopra le cellule ciliate sensoriali; ora rimuovere i tessuti e l'osso in eccesso e appiattire il preparato con le pinzette.

Questo è necessario affinché il tessuto possa essere posizionato uniformemente sotto un perno. La dissezione è ora terminata. Posizionare il preparato sotto il perno sul vetrino coprioggetto preparato, avendo cura di collocare il perno lontano dalle cellule ciliate una volta completata la dissezione.

Utilizzare pinzette per trasferire il preparato nella camera di registrazione, mantenendo una goccia di liquido extracellulare sul vetrino che sostiene il tessuto cocleare, e iniziare immediatamente la perfusione con soluzione extracellulare. Per garantire una migliore sopravvivenza del preparato, utilizzare l'obiettivo da 10x o l'obiettivo DIC ad immersione in acqua da 40x del microscopio. Per individuare il preparato, orientarlo in modo che gli elettrodi di registrazione possano avvicinarsi alle cellule ciliate interne perpendicolarmente alle loro pareti laterali.

Se la visibilità della regione basale delle cellule ciliate interne è limitata perché il preparato è arrotolato, utilizzare un elettrodo di registrazione per spingere il margine esterno del preparato contro il vetrino coprioggetto, avendo cura di non premere direttamente sulle cellule ciliate interne. In questo preparato, l'elettrodo superiore tiene premuto il margine esterno del preparato, mentre l'elettrodo inferiore indica la posizione dei bastoncelli afferenti.

Per riferimento, la telecamera NC 70 Nuv Con visualizza sul monitor l'immagine ingrandita al Forex per valutare se il tessuto nella regione delle cellule ciliate interne è sano. Individuare i fasci cigliari come punto di riferimento e mettere a fuoco in profondità fino a trovare i nuclei. Proseguire ulteriormente verso la base delle cellule ciliate interne con le relative terminazioni afferenti, quindi risalire fino a raggiungere sul monitor il livello dei nuclei.

Ora individuare i bastoncelli afferenti intorno alla base delle cellule ciliate interne. I bastoncelli sono sferici o ellissoidali, hanno un diametro di circa un micron ed hanno un colore chiaro con aspetto lucente. È possibile trovarli regolando il fuoco verso l'alto e verso il basso.

Il passo successivo consiste nel liberare un percorso verso le fibre afferenti utilizzando un elettrodo di registrazione con una punta di un micron riempita con soluzione intracellulare. Applicare una pressione positiva e utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'elettrodo sulla preparazione. Utilizzare questo elettrodo per effettuare un'incisione nella preparazione a livello della base delle cellule ciliate interne.

Spingere l'elettrodo tra lo strato sottile di cellule di sostegno e le cellule ciliate interne utilizzando una pressione positiva per creare un percorso di accesso alla zona alla base delle cellule ciliate interne. Rimuovere con attenzione l'elettrodo e sostituirlo con un elettrodo nuovo dotato di una punta dal diametro di un micron riempita con soluzione intracellulare. Utilizzando la pressione positiva per mantenere pulita la punta dell'elettrodo, spostare l'elettrodo di registrazione attraverso il foro di accesso attorno alle cellule di sostegno adiacenti verso il bastoncello afferente.

Assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia direttamente di fronte al baton afferente; i baton offrono maggiore resistenza al movimento della pipetta rispetto alle cellule di sostegno e alla membrana della cellula ciliata interna. Questa differenza può essere percepita mentre si muove la pipetta; spostare la pipetta su e giù e spingere per verificare che il bhuton si muova. Ciò indica che la punta della pipetta e il bhuton si trovano nello stesso piano di fuoco, con l'elettrodo premuto contro il bhuton afferente. Rilasciare contemporaneamente la pressione positiva e applicare aspirazione per formare un sigillo gigaohm.

Applicare delicati impulsi di aspirazione per rompere la membrana all'interno dell'elettrodo e ottenere una registrazione in modalità cella intera. Se la cellula sigillata è un bastoncino afferente, si osservano piccoli transitori capacitivi in modalità registrazione in cella intera. Questa figura mostra un transitorio tipico registrato da una fibra afferente.

Iniziare la registrazione dell'attività sinaptica. Se la fibra afferente non mostra un'attività spontanea, depolarizzare la cellula ciliata applicando una soluzione extracellulare con una concentrazione più elevata di potassio. Questa figura mostra le relazioni tipiche tra corrente e tensione per le fibre AFF a sinistra e le cellule ciliate interne a destra.

Le relazioni corrente-tensione sono state registrate a un potenziale di mantenimento di meno 84 millivolt con incrementi di tensione da meno 124 millivolt a più 36 millivolt in passi di 10 millivolt. Le tensioni sono mostrate a destra di alcuni tracciati, concentrati sulle relazioni corrente-tensione di una fibra afferente. Si noti che le correnti postsinaptiche eccitatorie, o EPC, sono presenti durante la maggior parte dei passi di tensione.

Le EPC hanno invertito un potenziale positivo a circa +6 mV. Questa registrazione è stata effettuata in presenza di tetradotossina per bloccare le correnti sodiche attivate dal voltaggio; senza questo bloccante, sarebbero comparse ulteriori correnti sodiche inward ad attivazione rapida, identificando la registrazione come proveniente da una fibra afferente. Si noti la corrente inward ad attivazione lenta a potenziali iperpolarizzanti.

Questa corrente non è presente nelle cellule ciliate interne né nelle cellule di sostegno e fornisce un buon indicatore del fatto che la registrazione proviene da una fibra afferente. Queste registrazioni mostrano le relazioni corrente-tensione per una cellula ciliata interna. La freccia indica le correnti di potassio uscenti ad attivazione rapida a potenziali positivi.

Questi sono seguiti da correnti al potassio rettificatrici ritardate a causa di un diametro ridotto della pipetta e di un'elevata resistenza di accesso. Le correnti delle cellule ciliate interne mostrate qui sono più piccole del previsto per ottenere registrazioni accurate delle correnti delle cellule ciliate interne. Si dovrebbero utilizzare pipette con resistenze di accesso più basse.

Tuttavia, le registrazioni presentate qui dimostrano che le relazioni corrente-tensione delle cellule ciliate interne e delle fibre afferenti possono essere chiaramente distinte. Questa figura mostra correnti sinaptiche registrate da una fibra afferente. Si noti la dimensione e la forma variabili degli EPC.

Le registrazioni sono state effettuate a temperatura ambiente con la tetra toina applicata per bloccare le correnti sodio dipendenti dal voltaggio. Questa figura mostra registrazioni simultanee da una cellula ciliata interna e da un bastoncino afferente contiguo. Un gradino di voltaggio è stato utilizzato per depolarizzare la cellula ciliata interna e, in risposta, sono state registrate correnti calcio entranti dalla cellula ciliata interna; l'afflusso di calcio provoca il rilascio del neurotrasmettitore e l'attivazione di correnti postsinaptiche eccitatorie (EPC) nel bastoncino afferente.

Si noti che la depressione sinaptica appare durante una depolarizzazione di 50 millisecondi della cellula ciliata interna mentre si esegue questa procedura. È importante ricordare di prestare attenzione durante la dissezione e la preparazione del tessuto cocleare e di mantenere pazienza e ottimismo quando si tenta di registrare dai terminali afferenti.