Un Microfluidic basato Trappola idrodinamico per particelle singole
21 gennaio 2011
In questo articolo presentiamo una microfluidica metodo basato per il confinamento delle particelle sulla base del flusso idrodinamico. Dimostriamo cattura stabile di particelle in un punto di ristagno del fluido utilizzando un meccanismo di controllo del feedback, consentendo in tal modo confinamento e micromanipolazione di particelle arbitrari in un microdispositivo integrato.
L'obiettivo generale di questo metodo è confinare e manipolare singole particelle su scala micro e nanometrica utilizzando un flusso laminare in un dispositivo microfluidico. La trappola idrodinamica è costituita da un dispositivo microfluidico con una geometria del canale a incrocio, che genera un flusso con punto di ristagno all'intersezione dei microcanali. Una valvola integrata posizionata in uno dei canali di uscita viene utilizzata per controllare attivamente il flusso del fluido e intrappolare le particelle.
Le particelle vengono confinate in un punto prefissato definito dall'utente mediante il controllo attivo della posizione del punto di ristagno. Un controllore a retroazione viene utilizzato per rilevare la posizione delle particelle e regolare la valvola su chip al fine di mantenere la posizione delle particelle nel punto desiderato. Utilizzando il trappolamento idrodinamico, singole particelle possono essere intrappolate in soluzioni di particelle diluite o concentrate e possono essere osservate mediante microscopia a fluorescenza o in campo chiaro.
Una singola particella può essere confinata entro un micron dal centro della trappia, come mostrato nella traiettoria della particella e nell'istogramma dello spostamento della particella rispetto al centro della trappia. Ciao, sono Eric Johnson Rio del laboratorio del Professor Charles Schroer del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare e del Centro di Biofisica e Biologia Computazionale dell'Università dell'Illinois. Ciao, mi chiamo Ari, sono un ricercatore postdottorato presso il laboratorio Schroeder.
Ciao, sono Cheryl Schroeder e oggi vi mostrerò come realizzare e utilizzare un dispositivo microfluidico per il confinamento idrodinamico di singole particelle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le trappole ottiche o elettrocinetiche, è che il confinamento idrodinamico viene ottenuto esclusivamente tramite l'azione del flusso del fluido, eliminando così potenziali campi esterni dannosi per il confinamento di nanoparticelle o cellule. Questa tecnica potrebbe rivoluzionare la scienza fondamentale e applicata, consentendo il confinamento in soluzione libera di particelle su scala micro e nanometrica senza alcun requisito relativo alle proprietà chimiche o fisiche della particella intrappolata.
Iniziamo. Per facilitare il distacco delle repliche dagli stampi in SU-8, silanizzare la superficie degli stampi in SU-8 posizionando le wafer in un essiccatore sotto vuoto per 10 minuti con una capsula di vetro contenente alcune gocce di triclorosilano, utilizzando una miscela di PDMS DGAs per gli strati fluidico e di controllo. Applicare per spin coating la miscela di PDMS 15:1 sullo stampo dello strato fluidico per 30 secondi a 750 giri al minuto, quindi inserire la wafer in una piastra di Petri.
Allo stesso modo, posizionare lo stampo del livello di controllo in una piastra di Petri e versare sopra lo stampo una miscela di PDMS in rapporto cinque a uno fino a uno spessore di quattro millimetri. Per polimerizzare parzialmente i livelli di PDMS, cuocere le wafer/PGMS per 30 minuti a 70 gradi Celsius e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente. Tagliare la replica di PDMS con il bisturi e staccarla delicatamente dallo stampo SU otto.
Quindi, con l'ago da 21 gauge, praticare un foro nel PDMS come porta di accesso al microcanale che fungerà da valvola a membrana su chip. Posizionare il replice in PDMS con lo strato di controllo sul wafer con lo strato fluidico in PDMS depositato per spin coating. Allineare con attenzione e sigillare lo strato di controllo allo strato fluidico utilizzando un microscopio stereoscopico.
Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria tra gli strati e cuocere a 70 gradi Celsius per tutta la notte per indurire completamente entrambi gli strati in una lastra monolitica di PDMS; dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, utilizzare un bisturi per tagliare e staccare il replica di PDMS dallo stampo SU eight e usare una lametta per rimuovere l'eccesso di PDMS e separare ogni unità del dispositivo. Procedere ora con la perforazione di fori di accesso ai microcanali nello strato fluidico mediante un ago da 21 gauge. Pulire un coprioggetto con acetone IPA e asciugare con azoto.
Trattare sia il vetrino che le superfici della replica in PDMS con plasma di ossigeno a 500 millitorr per 30 secondi. Successivamente, mettere immediatamente a contatto le due superfici per formare un sigillo irreversibile. Infine, cuocere i dispositivi tutta la notte per aumentare l'adesione tra gli strati di PDMS e il vetrino.
Posizionare innanzitutto il dispositivo microfluidico sul piatto di un microscopio invertito e fissarlo con le clip del piatto. Successivamente, per somministrare le soluzioni al dispositivo microfluidico, riempire una siringa da un millilitro e una siringa gastight da 250 microlitri rispettivamente con soluzione tampone e con il campione. Utilizzare una valvola a T tra la siringa del campione e la porta del campione sul dispositivo microfluidico per controllare l'erogazione del campione.
Ora stabilire le connessioni fluidiche tra le siringhe e il dispositivo microfluidico, utilizzando tubi in perfluoruro di ossigeno, adattatori con bloccaggio a baionetta e tubi metallici da 24 gauge. Successivamente, stabilire le connessioni fluidiche per i canali di uscita nel dispositivo microfluidico mediante tubi in PFA e tubi metallici da 24 gauge. Per mantenere una caduta di pressione costante tra le siringhe e i canali di uscita, i tubi in PFA per le uscite devono avere la stessa lunghezza e devono essere entrambi immersi in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri riempita con soluzione tampone.
Riempire la valvola su chip con olio fluorurato di trasporto utilizzando una siringa di plastica da tre millilitri con blocco a esca per evitare che l'aria penetri nel livello fluidico durante il funzionamento. Spingere l'aria nella camera della valvola attraverso la membrana in PDMS e nel microcanale. Nel livello fluidico.
Per il funzionamento delle valvole su chip. Collegare un'approvvigionamento di gas inerte sotto pressione al collegamento nel livello di controllo. Sciacquare le connessioni fluide e il dispositivo microfluidico con 0,5 millilitri di soluzione tampone per assicurarsi che tutte le bolle d'aria siano rimosse dal sistema, inclusi i canali di uscita.
I flussi tipici utilizzati per rimuovere le bolle d'aria variano tra 2000 e 5.000 microlitri all'ora; dopo aver eliminato le bolle d'aria dai canali microfluidici, ridurre il flusso a 50-100 microlitri all'ora, che è un flusso volumetrico tipico per l'intrappolamento delle particelle. Passare ora la valvola T in modo da permettere al campione di fluire nel dispositivo microfluidico. Eseguire il codice personalizzato in lab view che automatizza l'intrappolamento delle particelle implementando un algoritmo di controllo a retroazione lineare.
Il codice acquisisce immagini da una telecamera CCD e trasmette un potenziale elettrico a un regolatore di pressione che modula attivamente la posizione di una valvola pneumatica su chip. Utilizzando lo stadio di traslazione XY del microscopio, posizionare la regione di trappolamento al centro del campo visivo della telecamera. Portare la regione di trappolamento a fuoco dell'obiettivo e regolare le impostazioni della telecamera per ottimizzare le condizioni di imaging.
Scegliere una regione rettangolare di interesse all'interno del campo visivo della telecamera in modo che il centro della ROI corrisponda alla posizione del centro del trappolamento. Inizializzare ora la pressione di offset applicata alla valvola su chip. Una strozzatura larga da 100 a 200 micron si trova nel canale di uscita opposto.
Fornisce una pressione di offset per il funzionamento della valvola su chip. Avviare il controllore a retroazione e regolare il guadagno proporzionale per ottimizzare la risposta del trappolamento. A seconda della portata e della posizione della valvola su chip, esiste un valore ottimale del guadagno proporzionale, che aumenta la stabilità del trappolamento ed elimina le oscillazioni indesiderate delle particelle.
Il codice della vista del laboratorio intrapperà automaticamente una delle particelle che entra nella regione di intrappolamento. In questo video, il movimento delle particelle nella direzione del flusso in ingresso è dovuto al fatto che il canale di ingresso del campione è lasciato aperto per massimizzare la rigidità del confinamento nella direzione del flusso in ingresso. L'utente può chiudere il canale del campione durante l'intrappolamento, bilanciando uniformemente il flusso nel giunto a croce, monitorare la particella intrappolata e mantenere la messa a fuoco della particella all'interno del piano dell'immagine utilizzando la messa a fuoco manuale o un sistema microscopico con messa a fuoco automatizzata.
Il dispositivo microfluidico integrato è costituito da un punto di focalizzazione del campione, da un incrocio a croce e da una valvola pneumatica. L'intrappolamento avviene all'incrocio a croce e la posizione della particella è controllata mediante regolazione attiva del campo di flusso al giunto del microcanale attraverso la valvola pneumatica. Qui, un'immagine di una singola perlina è confinata nella trappia idrodinamica. Oltre alla perlina al centro della trappia, diverse perline non intrappolate sono visibili nella regione di intrappolamento all'incrocio a croce.
Viene mappata la traiettoria di una microsfera fluorescente in polistirene da 2,2 micron intrappolata. La particella viene inizialmente trattenuta per tre minuti. Successivamente viene rilasciata dall'oggetto intrappolato ed esce lungo uno dei canali di uscita.
Un istogramma dello spostamento di una microsfera intrappolata rispetto al centro della trappia lungo la direzione dei canali di uscita indica che la particella è confinata entro un micrometro dal centro della trappia. Oggi abbiamo presentato la trappia EM come metodo per l'intrappolamento in soluzione libera di particelle su scala micro e nanometrica, mediante un punto di stagnazione generato all'interno di un dispositivo microfluidico. L'intrappolamento idrodinamico consente il confinamento di una singola particella bersaglio in sospensioni concentrate di particelle, cosa che risulta difficile con metodi alternativi di intrappolamento basati su campi di forza.
Dopo ulteriori sviluppi, questa nuova tecnica permetterà esplorazioni scientifiche nei campi della biofisica, meccanica cellulare, dinamica dei fluidi, enzimologia e biologia dei sistemi. Grazie per aver guardato e speriamo che questa tecnica si riveli utile per i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo basato sulla microfluidica per il confinamento e la manipolazione di particelle su scala micro e nanometrica mediante flusso idrodinamico. Viene impiegato un meccanismo di controllo a retroazione per ottenere un intrappolamento stabile delle particelle in un punto di stagnazione del fluido all'interno di un microdispositivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Manipolazione di particelle
- Trappolamento idrodinamico
Sfondo
- I dispositivi microfluidici permettono un controllo preciso del flusso dei fluidi.
- I trappole idrodinamiche possono confinare particelle in posizioni specifiche.
- I meccanismi di controllo attivo migliorano le capacità di manipolazione delle particelle.
- La microscopia a fluorescenza e in campo chiaro può essere utilizzata per l'immagine delle particelle.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per intrappolare singole particelle in dispositivi microfluidici.
- Utilizzare il flusso laminare per un efficace confinamento delle particelle.
- Implementare un controllo a retroazione per mantenere la posizione delle particelle.
Metodi Utilizzati
- Dispositivo microfluidico con geometria del canale a incrocio.
- Valvola su chip per il controllo attivo del flusso del fluido.
- Controllore a retroazione per tracciare e regolare la posizione delle particelle.
- Tecniche di imaging come microscopia a fluorescenza e in campo chiaro.
Risultati principali
- Trappaggio con successo di singole particelle sia in soluzioni diluite che concentrate.
- Dimostrata stabilità del confinamento delle particelle in un punto di regolazione definito dall'utente.
- Regolazione efficace della posizione del punto di ristagno mediante controllo in retroazione.
- Capacità di acquisire immagini delle particelle intrappolate mediante tecniche di microscopia.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio robusto per la manipolazione di particelle nei sistemi microfluidici.
- I meccanismi di controllo attivo migliorano la precisione del confinamento delle particelle.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi campi che richiedono il confinamento di particelle.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa trappola idrodinamica microfluidica consente il confinamento senza etichette e senza campi di singole particelle micro- e nanometriche in sospensioni biologiche complesse, supportando la validazione precoce di bersagli mediante l'osservazione diretta del comportamento delle particelle senza immobilizzazione superficiale né campi perturbativi. Il metodo fornisce un controllo spaziale quantitativo e una stabilità a lungo termine per la riduzione del rischio meccanicistica delle interazioni tra nanoparticelle e biomolecole nei flussi di scoperta. La sua compatibilità con campioni concentrati e con tipi arbitrari di particelle aumenta la rilevanza traslazionale per lo screening preclinico di vettori per il rilascio di farmaci e di vescicole extracellulari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche intrappolando singole particelle in soluzione libera per osservare interazioni nello stato nativo, senza artefatti dovuti a campi ottici, magnetici o elettrici.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli in ambienti affollati, come sieri o lisati cellulari, dove l'intrappolamento convenzionale fallisce a causa di interferenze di fondo.
- Valore predittivo: Facilita l'identificazione di composti promettenti permettendo un'osservazione prolungata della dinamica delle particelle per valutare la cinetica di legame e la stabilità in condizioni prossime a quelle fisiologiche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi di particelle validati per flussi di lavoro successivi, consentendo l'isolamento e la manipolazione di singole entità provenienti da popolazioni eterogenee.
- Output quantitativo: Genera istogrammi di spostamento e dati di traiettoria che fungono da metriche riproducibili per confrontare il comportamento delle particelle in diverse condizioni.
- Scalabilità della piattaforma: Si integra con dispositivi microfluidici esistenti tramite valvole pneumatiche su chip, consentendo il riutilizzo su più target e aumentando la produttività nei processi di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Mantiene la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica intrappolando particelle in matrici biologicamente rilevanti senza alterarne la chimica superficiale.
- Avanzamento basato sul rischio: Permette la riduzione del rischio meccanicistica delle formulazioni di nanoparticelle quantificando la stabilità del confinamento come indicatore dell'integrità colloidale in fluidi complessi.
- Allineamento con i biomarcatori: Supporta studi traslazionali sui biomarcatori consentendo l'osservazione a lungo termine di singole vescicole extracellulari o di nanoparticelle lipidiche in biofluidi non diluiti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, in particolare per studi che richiedono l'analisi delle particelle non perturbate in ambienti naturali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo la visualizzazione diretta delle interazioni tra singole particelle in soluzione, senza l'uso di marcatori né di ancoraggio superficiale.
- Screening: Migliora la riproducibilità dei saggi grazie a un controllo attivo del flusso che mantiene condizioni di intrappolamento costanti tra diverse prove, riducendo la variabilità nei saggi basati su particelle.
- Analisi: Fornisce il tracciamento del baricentro e misurazioni degli spostamenti come letture quantitative per confrontare le risposte delle particelle in diverse condizioni di tampone o ligando.
- Ricerca traslazionale: Si collega al lavoro preclinico permettendo la valutazione del comportamento delle particelle in fluidi biologici concentrati che imitano condizioni in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come modulo di intrappolamento modulare che può essere integrato in diverse piattaforme microfluidiche, riducendo i costi di sviluppo ripetuto tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta l'affidabilità predittiva eliminando gli artefatti indotti dal campo e consentendo l'osservazione degli stati nativi delle particelle in sospensione.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante il posizionamento controllato in retroazione del punto di ristagno, assicurando prestazioni costanti della trappola tra diversi utenti e sessioni.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di tipo go/no-go fornendo dati precoci e quantitativi sulla stabilità delle particelle e sulla loro propensione alle interazioni in matrici realistiche.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione basata sulla valutazione del rischio dei candidati nanoparticellati o di vescicole, in base alla stabilità del confinamento a livello di singola particella in fluidi complessi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di microfluidica, nella microscopia a fluorescenza e nei sistemi di controllo retroazionato come l'elaborazione delle immagini basata su LabVIEW e la regolazione della pressione.
- Si basa su regolatori di pressione pneumatici, valvole su chip e infrastrutture per l'acquisizione di immagini ad alta velocità per il tracciamento in tempo reale delle particelle e la regolazione del flusso.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro dei protocolli di calibrazione delle valvole e dei parametri di tracciamento delle particelle per garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a particelle non sferiche o deformabili, poiché l'efficienza di trappolamento può variare in base alla forma e alle dimensioni sotto flusso estensionale.
- Comprende limitazioni pratiche come la necessità di fluorescenza o contrasto delle particelle per un tracciamento affidabile, e la possibile deriva durante esperimenti prolungati che richiede una ricaribrazione periodica.
