Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

I dispositivi, così come li abbiamo preparati, vengono confezionati in kit da 10 o 20; al momento della consegna, vengono spedite in una scatola refrigerata e il kit contiene tutti i componenti necessari per l'esecuzione. L'esperimento incluso nel kit comprende un pacchetto con tutte le siringhe e i tamponi, che possono essere conservati a temperatura ambiente. È inoltre inclusa una copia del protocollo che seguiremo in questo esperimento.

È presente anche una cella frigorifera, che contiene i dispositivi veri e propri e tutti i tamponi di corsa che devono essere conservati in frigorifero. In genere, i kit sono confezionati in gruppi da 10 o 20. Quando non vengono utilizzati, i kit devono essere conservati in frigorifero.

Ogni siringa e ogni componente del kit è accuratamente etichettato e le etichette corrispondono alla tabella presente nel protocollo che seguiamo. Pertanto, non vi è alcuna ambiguità riguardo a quale siringa o componente del kit utilizzare nei singoli passaggi. Dopo aver disimballato i dispositivi e averli posizionati all'interno di una cappa biologica, eseguiremo la procedura di isolamento dei neutrofili e la loro lisi per applicazioni genomiche successive, poiché il campione biologico ottenuto verrà utilizzato per l'isolamento oppure per l'estrazione dell'RNA dal lisato cellulare.

Per questo motivo, dobbiamo assicurarci che la nostra area sia pulita, non solo in senso sterile, ma anche priva di qualsiasi RNA presente normalmente nell'ambiente. È quindi molto importante pulire accuratamente tutta l'area di lavoro e tutti i dispositivi con una soluzione che distrugga gli RNA. Di solito puliamo tutti gli strumenti e le superfici di lavoro con RNA SAP o RNAs away, disponibili presso diversi produttori.

Il dispositivo è fornito in un sacchetto sigillato termicamente. Ogni dispositivo è sigillato e dotato di codice a barre. È consigliabile prendere nota di questo codice a barre se si lavora con campioni clinici.

Quindi il dispositivo è aperto, il coperchio viene rimosso e viene posizionato nel manifold di mantenimento della pompa. Il campione di sangue che utilizziamo è un campione di sangue intero. Lo faremo passare attraverso una siringa BD standard da un millilitro, contrassegnata come siringa uno.

Di solito si procede rimuovendo la siringa dalla confezione e togliendo con attenzione il cappuccio dal tubo per il sangue. Successivamente si prelevano 700 microlitri o 0,7 ml di sangue e se ne inietta la metà, ovvero 350 microlitri, in un tubo da 1,5 ml. In questo modo il sangue può essere trasferito per ulteriori lavorazioni.

Il tuo, il tuo tubo di sangue può essere trasferito e tuttavia hai ancora del sangue residuo in caso di malfunzionamento del dispositivo. Quindi ora procederemo inserendo la siringa contenente sangue su questo ago, che è collegato a un tratto di tubo con questo dispositivo, con attenzione particolare al dispositivo di isolamento microfluidico.

Dobbiamo fare molta attenzione a non introdurre bolle d'aria nel dispositivo, altrimenti il dispositivo potrebbe malfunzionare. Di solito prendiamo la siringa e spingiamo lo stantuffo, aggiungendo il liquido sulla superficie superiore del dispositivo, assicurandoci che sia completamente in contatto prima di espellere tutto il liquido. A questo punto ci fermiamo e rimuoviamo con cura il corpo della siringa dall'ago, riempiendo sostanzialmente la punta dell'ago o il connettore del lure con il buffer rimanente all'interno della siringa.

Eliminiamo questo. Successivamente prenderemo la nostra siringa con il sangue e la inseriremo nel connettore a baionetta. Avendo cura di non versare il sangue e di non introdurre bolle d'aria.

Si consiglia di utilizzare un guanto monouso tenendo il corpo della siringa e il tubicino, nel caso in cui si verifichi una fuoriuscita di sangue. Una volta collegata la siringa al connettore del tubicino o all'ago, si danno alcuni colpetti decisi per rimuovere eventuali bolle d'aria presenti nel connettore. Successivamente, questa siringa viene inserita nella pompa per siringa e fissata con la vite di bloccaggio.

La pompa per siringa viene accesa ed è già preimpostata alle nostre condizioni di flusso. Faremo scorrere questo sangue attraverso il dispositivo a 30 microlitri al minuto. Una volta inserito il corpo della siringa nella pompa per siringa, premeremo il pulsante sul braccio mobile dello stantuffo e lo faremo scorrere verso il basso finché non toccherà la sommità dello stantuffo e inizierà a spingere il fluido fuori attraverso la punta di questa.

È un ago in acciaio inossidabile con punta smussata. Una volta verificato che il sistema è stato preparato, premeremo il tasto di avvio. Per iniziare il flusso del sangue, premete stop per arrestarlo, quindi prendete un tubo da centrifuga pulito da 1,5 ml o un tubo fendor e procederemo a scollegare con attenzione.

Scollegare solo uno, staccare il tubo da una porta del dispositivo. Una volta scollegato questo tubo, lo inseriremo nel tubo fender da 1,5 mil. Premetteremo esegui per far ripartire il flusso sanguigno.

E quando vediamo formarsi una goccia di sangue, fermiamo la pompa e la inseriamo nell'ingresso che abbiamo appena aperto nel dispositivo. Premiamo "esegui" per avviare il flusso di sangue e impostiamo un timer di cinque minuti. Dobbiamo assicurarci che il sangue riempia in modo uniforme tutte le camere e che non ci siano evidenti bolle d'aria nel dispositivo.

Se ci sono bolle d'aria che ostruiscono il flusso in una delle camere, è possibile utilizzare una pinzetta e farla scorrere lungo i canali minuscoli che portano alle camere di cattura o lungo i canali minuscoli che escono dalle camere di cattura. Il dispositivo si sta riempiendo correttamente, quindi dopo cinque minuti si preme stop sulla pompa per siringa per arrestare il flusso di sangue, si allenta la clip della siringa e la si rimuove dal supporto della pompa per siringa. Successivamente utilizzeremo la siringa numero tre, che è caricata con PBS privo di nucleasi. La useremo, in pratica, per assicurarci nuovamente che la superficie del dispositivo sia ben aderente, in modo da evitare bolle d'aria; batteremo sulla siringa per far sì che eventuali bolle d'aria risalgano nella parte superiore del corpo della siringa.

Allentare il braccio sulla pompa per siringa e inserire la siringa da tre millilitri nella pompa. Stringerla bene, quindi premere lo stantuffo fino a quando non entra in contatto con lo stantuffo della siringa. Premere "esegui" e attendere che il liquido raggiunga e prepari il dispositivo, quindi attendere di vedere una goccia sulla punta dell'ago in acciaio inossidabile.

Quando si osserva la formazione di una goccia, si arresta la pompa. Rimuoveremo il sangue, la punta in acciaio inossidabile contenente il sangue. Inseriremo quindi il buffer di lavaggio e premeremo esegui.

E lasceremo funzionare il sistema per cinque minuti. Dovete prendere un panno pulito e asciugare qualsiasi piccola quantità di sangue che potrebbe trovarsi all'ingresso o all'uscita. Dopo cinque minuti di passaggio del buffer di lavaggio attraverso il dispositivo, il dispositivo dovrebbe essere completamente privo di sangue e potete verificarlo osservando che non ci sarà più sangue rosso all'interno del dispositivo, che apparirà trasparente. Quindi, quello che faremo dopo i cinque minuti è interrompere il passaggio del buffer di lavaggio.

E ancora, rimuoveremo la siringa dalla pompa per siringhe. Chiuderemo il tubo microcentrifuga da 1,5 ml direttamente sul tubo flessibile di uscita. E solleveremo con attenzione il tubo, il tubo microcentrifuga, tirando il tubo di scarto fuori dal dispositivo.

Lo getteremo via in un contenitore per rifiuti biologici. Nel kit è presente un nuovo tubo di uscita, che è in realtà realizzato in Teflon. Ha nuovamente una punta in acciaio inossidabile.

Sostituiremo il vecchio tubo di uscita con questo nuovo tubo di uscita. Prenderemo quel tubo di uscita e cercheremo di piegarlo in una forma simile a una U o a una V. Inoltre, il kit include una colonna kaya shredder, che frammenta il DNA e sostanzialmente omogeneizza la sospensione cellulare.

Quindi apriremo il tappo viola della colonna trituratrice e posizioneremo il tubo di uscita nella colonna Kay Shredder. Preleveremo dal kit la siringa numero due, indicata per RLT, che utilizzeremo. Si tratta di una siringa standard BD da un millilitro con ago da 22 gauge a punta smussata in acciaio inossidabile.

Utilizzeremo questo per iniettare 350 microlitri di RLT standard da kyogen nel dispositivo. Poiché il dispositivo ha un volume morto di circa 50 microlitri, dobbiamo iniettare il RLT, ma dietro il RLT vogliamo iniettare un tappo d'aria, per rilasciare quel volume morto del dispositivo nella colonna del chi shredder. Quindi procederemo nel seguente modo: prenderemo la nostra siringa, aspireremo 350 microlitri di aria e successivamente 350 microlitri o 0,35 ml di RLT, posizionando così il RLT in fondo alla siringa.

Resistete alla tentazione di capovolgere la siringa e di iniettare l'aria. L'aria è presente per assicurarsi che tutto il RLT entri nella nostra colonna Kay shredder. Ora rimuoveremo il tubo dal buffer di lavaggio.

Inseriremo la nostra siringa con l'RLT e inietteremo lentamente l'RLT nel dispositivo per un periodo di circa 30 secondi, assicurandoci che il tubo di uscita scarichi il suo rifiuto nella colonna del trituratore chi. Una volta che l'aria inizia a essere iniettata nel dispositivo, premere verso il basso sullo stantuffo e attendere che tutto il liquido venga rilasciato nella colonna del trituratore Kay. Chiudiamo la colonna del trituratore Kay e la centrifughiamo su una microcentrifuga bilanciata a 15.000 giri/min o al massimo regime della microcentrifuga da banco per due minuti.

Dopo aver centrifugato la colonna per due minuti, preleveremo il campione, che ora si trova in RLT, e lo trasferiremo in una delle provette criogeniche fornite con tappo viola. Se si lavora con un campione clinico, etichetterete queste provette criogeniche all'inizio dell'esperimento. Ecco il lisato nella provetta criogenica.

Questo vial criogenico viene immediatamente posto in un congelatore a -80 °C e conservato per la spedizione o per una successiva estrazione dell'RNA. Questo è quindi un protocollo alternativo per l'isolamento dei neutrofili. Invece di lisare le cellule con il buffer RLT, le sottoporremo a colorazione con un comune colorante istologico.

Una macchia. Quindi preleviamo il dispositivo sigillato dal sacchetto e lo sballiamo nuovamente, annotiamo il numero di lotto presente sul dispositivo e posizioniamo la piastra di Petri nel supporto per piastre di Petri.

Prenderemo la siringa da un millilitro dal suo sacchetto, siringa numero uno, la riempiremo con 700 microlitri di sangue e inietteremo la metà, 350 microlitri, in un tubo eppendorf DPH. Metteremo da parte. Prendiamo la siringa numero quattro, che ha il tubicino che useremo per l'iniezione, e iniettiamo il sangue nel dispositivo.

Tenere la base dell'ago dal tubicino in modo chimico. Rimuovere il corpo della siringa e riempire il lure. L'adattatore bufferizzerà e smaltirà la siringa.

Inseriremo la siringa contenente sangue nell'ago utilizzando il disinfettante chimico per raccogliere eventuali fuoriuscite. Daremo dei colpetti alla siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria presenti al giunto tra l'ago e il corpo della siringa. Caricheremo la siringa nella pompa per siringhe e preriempleremo il tubicino spingendo verso il basso il braccio mobile della pompa.

Scollegheremo il tubo da uno degli sbocchi del dispositivo, il dispositivo di cattura, e lo posizioneremo in una provetta da 1,5 ml. Quindi inizieremo a far scorrere il sangue premendo il tasto di avvio sulla pompa per siringa. Attenderemo la formazione di una goccia di sangue sulla punta in acciaio inossidabile.

Una volta formata la goccia, premere stop, asciugare il sangue, inserirlo nel dispositivo e premere esegui. Ora impostiamo un timer di cinque minuti. Bene, dopo aver fatto scorrere il campione attraverso il dispositivo per cinque minuti, premere stop sulla pompa per siringa e rilasciare la siringa.

E sostituiremo quella siringa con la siringa da tre millilitri contenente il nostro buffer di lavaggio, che è semplicemente un XPBS. Ancora una volta, dobbiamo assicurarci che la parte superiore del dispositivo sia chiusa e quindi rimuoveremo la punta dell'ago contenente sangue o plus run. Iniziare a preparare il dispositivo.

Creeremo delle goccioline, le inseriremo nel dispositivo e avvieremo il processo, asciugando qualsiasi traccia di sangue presente nel tubo di ingresso o in quello di uscita, quindi lasceremo scorrere il flusso per cinque minuti dopo il passaggio di lavaggio. Successivamente, fermeremo la pompa a siringa e rimuoveremo la siringa dal supporto della pompa. Per eseguire la standard GIM sustaining, fisseremo innanzitutto le cellule e le disidrateremo utilizzando metanolo al 100%.

Quindi, abbiamo una siringa da tre millilitri precaricata con metanolo. Ancora una volta, procediamo con la preparazione della siringa, assicurandoci che il metanolo scorra, fermiamo la pompa della siringa, inseriamo la siringa nel dispositivo e premiamo "esegui". Fisseremo i campioni in questa soluzione di metanolo per due-quattro minuti.

Dopo due o quattro minuti di fissaggio con metanolo, fermiamo la pompa, rimuoviamo la siringa contenente metanolo e in questa fase carichiamo una siringa da tre millilitri contenente eem sustain standard (eem sustain di Sigma) diluito uno a cinque in acqua deionizzata. Dopo aver effettuato la diluizione, carichiamo la soluzione nella siringa e, all'estremità della siringa, montiamo un filtro da 0,8 micron per rimuovere eventuali particelle che potrebbero ostruire il dispositivo. Lasciamo la colorazione agire per cinque o dieci minuti.

E poi risciacqueremo con acqua deionizzata. Dopo cinque-dieci minuti di colorazione, fermeremo la pompa a siringa e sostituiremo la siringa contenente il buffer di colorazione con quella contenente acqua deionizzata; fondamentalmente effettueremo un lavaggio fino a quando non vedremo che il colore blu del SAI è stato rimosso dal dispositivo. Una volta che l'eccesso di gim sustain è stato risciacquato dal dispositivo, interromperemo la soluzione di lavaggio.

E poi quello che faremo è rimuovere la siringa dell'acqua dall'ingresso. Successivamente prenderemo il tubo di uscita del dispositivo. Afferreremo quel tubo alla sua estremità con le pinzette.

Questo è un tubo flessibile in teflon che reinseriràmo nell'ingresso del dispositivo. Ciò sigilla il dispositivo e mantiene le cellule idratate e la loro morfologia intatta. Ora il mio collega, il dottor John Hong Chang, mostrerà un protocollo alternativo per l'isolamento di linfociti positivi per CD4, seguito da una colorazione immunofluorescente direttamente all'interno del dispositivo microfluidico.

Il mio nome è Shong Hong e oggi vi mostrerò la colorazione cellulare in un dispositivo microfluidico. A questo stadio, ho già mostrato come utilizzare un dispositivo microfluidico per l'isolamento mediante affinità immunochemica per isolare in modo specifico cellule del sangue da sangue intero in condizioni senza precedenti. Per il suo scopo, desidera lisare le cellule ed estrarre il contenuto proteico e di DNA da quelle cellule isolate. Per quanto riguarda il mio ambito di ricerca, sono interessato a ottenere le cellule e quindi determinarne il numero, ad esempio ottenere il conteggio delle cellule CD4 dal sangue intero e utilizzarlo come indicatore a fini diagnostici.

Pertanto, il dispositivo utilizzato è molto simile al dispositivo di Ken. È realizzato in una camera rettilinea in P-D-M-S-A. La geometria è leggermente diversa, quindi i parametri operativi sono leggermente differenti, anche se in generale la procedura operativa complessiva è molto simile.

Quindi salterò tutti i passaggi di cattura e lavaggio delle cellule e passerò direttamente al passaggio di colorazione cellulare nelle procedure di conteggio cellulare. Qui ho un dispositivo in cui metà delle cellule è già stata catturata dal sangue intero e il dispositivo è già stato lavato con PBS. Le cellule in eccesso sono già state eliminate dal dispositivo e ho preparato in anticipo una miscela di anticorpi utilizzata specificamente per etichettare le cellule isolate nel dispositivo.

La concentrazione di anticorpo che abbiamo utilizzato qui è stata ottimizzata per colorare le cellule con un'intensità fluorescente molto elevata al microscopio a fluorescenza. La procedura è quindi piuttosto semplice. Si carica la siringa contenente la soluzione di anticorpo sulla pompa per siringhe e ci si assicura che la velocità di flusso sia impostata sui parametri corretti necessari.

Quindi avvieremo la pompa per siringa, osserveremo l'estremità del tubo, assicurandoci che la soluzione fuoriesca già in modo che non ci siano più bolle all'interno del tubo. Dopodiché possiamo collegare il tubo al dispositivo microfluidico in cui abbiamo catturato le cellule. A questo punto l'anticorpo fluisce nel dispositivo per colorare le cellule che abbiamo isolato all'interno del dispositivo. La portata utilizzata è di cinque microlitri al minuto, ma a seconda della geometria del dispositivo potrebbero essere necessari diversi parametri di flusso in base al vostro scopo.

E lasceremo scorrere la soluzione di anticorpi per cinque minuti, un tempo sufficiente a sostituire completamente il volume di soluzione all'interno del canale microfluidico. Pertanto, dopo l'iniezione dell'anticorpo, interromperemo il flusso. Iniettiamo l'anticorpo a una portata di cinque microlitri al minuto per cinque minuti, in modo da rimpiazzare interamente la soluzione presente nel microcanale.

Successivamente interrompiamo il flusso e lasciamo che il dispositivo incubi a temperatura ambiente per 30 minuti. Questa fase deve essere eseguita al buio, in modo che l'anticorpo non venga spento durante l'incubazione delle cellule con un anticorpo marcato fluorescentemente, poiché la fluorescenza può essere attenuata. Dopo la colorazione, che di solito dura da 15 a 30 minuti, stacchiamo semplicemente il tubicino dal dispositivo e sostituiamo la siringa contenente l'anticorpo con una siringa contenente tampone, per rimuovere l'anticorpo non legato dal dispositivo.

Quindi la soluzione di lavaggio contiene il 1% di BSA in soluzione PBS. La BSA viene utilizzata per bloccare il legame non specifico dell'anticorpo sulla superficie e faremo la stessa cosa. Per prima cosa regoliamo la velocità di flusso sulla pompa per siringa per assicurarci che sia la velocità desiderata, quindi avviamo la pompa per siringa e verifichiamo che fuoriesca effettivamente del liquido dal tubicino prima di collegarlo al dispositivo.

Lo scopo di questa operazione è eliminare eventuali bolle rimaste all'interno della tubazione. In questo modo, durante l'iniezione, nessuna bolla entrerà nel nostro dispositivo. Collegando semplicemente la tubazione al dispositivo, lasciamo scorrere il liquido per altri cinque minuti al fine di sostituire completamente il lavaggio e rimuovere tutti gli anticorpi non legati dal dispositivo.

Dopo il passaggio di lavaggio, fisseremo le cellule con PFA al 1%. Lo scopo di questa operazione è consentire la conservazione del dispositivo per alcune settimane, nel caso in cui l'acquisizione delle immagini non possa essere eseguita immediatamente. La procedura è quindi piuttosto semplice.

È simile a quanto fatto in precedenza. Carichiamo la siringa sulla pompa, regoliamo la portata al valore desiderato, quindi avviamo la pompa per siringa e colleghiamo il tubicino al nostro dispositivo per iniettare la soluzione di paraformaldeide, ovvero il fissativo, nel dispositivo al fine di fissare le cellule. Ancora una volta, lasciamo scorrere il liquido per circa cinque minuti.

Quindi la PFA sostituisce tutto il buffer nel dispositivo per fissare tutte le cellule presenti. Dopo il passaggio di fissazione con PFA, si rimuove semplicemente la siringa contenente la PFA e il dispositivo è pronto per l'acquisizione delle immagini. In alcuni casi, si desidera effettuare una colorazione del nucleo per sovrapporla alla colorazione del marcatore di superficie cellulare.

Pertanto, a tale scopo si eseguirà la colorazione del nucleo utilizzando DPI alla fine. Si carica semplicemente la siringa con DPI, si accende la pompa per siringa e si fa fluire il DPI nel nostro dispositivo. A questo punto, il nucleo verrà colorato all'interno di quelle cellule per mostrare la loro posizione.

E questa, l'immagine di colorazione con DPI potrà successivamente essere sovrapposta alla colorazione del marcatore di superficie per mostrare la posizione delle cellule. Pertanto, al termine della colorazione con DPI, dobbiamo nuovamente lavare via il DPI L band P con soluzione tampone. Ancora una volta, utilizziamo PBS contenente 1% BSA per rimuovere il DPI non legato.

E l'operazione è simile a quella che abbiamo già eseguito in precedenza. Inseriamo semplicemente la siringa contenente il tampone nel nostro dispositivo e lasciamo fluire il tampone all'interno del dispositivo per rimuovere il dap non legato. Questa è quindi l'intera procedura di colorazione delle cellule in un dispositivo microfluidico.

E dopo tutte le procedure di colorazione, i dispositivi sono pronti per l'acquisizione delle immagini. E poiché è stata effettuata la fissazione con PFA, i dispositivi possono anche essere conservati per alcune settimane, qualora l'acquisizione delle immagini non possa essere eseguita immediatamente.