Sottocutaneo infezione di Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare la sopravvivenza e la diffusione dello staphylococcus aureus resistente alla meticillina, o MA, nonché i livelli di chemochine e citochine nei siti di infezione. Questo viene ottenuto rimuovendo il pelo dalla schiena dei topi per consentire un'area chiara di osservazione. Come secondo passaggio.

MRSA in sospensione verrà somministrato ai topi per via sottocutanea tre giorni dopo l'infezione; le patologie infettive e il numero di batteri possono essere valutati determinando il numero di unità formanti colonie da omogenati di tessuto su piastre di agar. Ciao, come stai? Mi chiamo De Lordon.

Sono un ricercatore post dottorato. Ciao, mi chiamo Mariel Sanchez. Sono una studentessa di dottorato e io sono Andrea Huda.

Sono un ricercatore associato, facciamo parte del laboratorio di George Lee del dipartimento di pediatria del Cedar-Sinai Medical Center. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo medico, come la modellizzazione di infezioni gravi, inclusa la miosite, la polimiosite e la fascite necrotizzante. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle infezioni gravi in regime di emergenza, può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo streptococco di gruppo A e altri organismi.

Inoltre, possiamo studiare la funzione e la patogenesi di altri organismi che causano miosite e polimiosite. In generale, le persone nuove a questa procedura potrebbero incontrare difficoltà perché uno del personale delle aree di coordinamento del regolatore globale è altamente mutevole. Se non si adottano precauzioni adeguate, i dati raccolti potrebbero presentare variazioni significative, il che renderà difficile l'interpretazione dei dati.

Iniziamo. In un impianto di sicurezza biologica di livello due, preparare una piastra di agar sangue di pecora su base TSA e un’ansa sterile utilizzando un blocco congelato. Trasferire la coltura stock di Mercer dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.

Quindi, utilizzando l'ansa sterile, staccare una piccola scheggia di ghiaccio dalla coltura madre e trasferirla sulla piastra. Dopo aver prelevato una piccola scheggia della coltura madre di Mercer, riporre immediatamente la coltura madre in freezer per evitare il disgelo, poiché cicli ripetuti di congelamento e scongelamento danneggerebbero la coltura madre. Utilizzare l'ansa per effettuare il semina a striscia sull'agar, favorendo la crescita di colonie individuali di Mercer.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte senza integrazione di CO2. Il giorno successivo, preparare ed etichettare sia un nuovo foglio di sangue con uovo, sia una piastra TSA e un tubo da 15 millilitri con tappo a scatto contenente tre millilitri di THB.

Recuperare la piastra M SSA coltivata durante la notte ed esaminare il fenotipo emolitico delle colonie. Utilizzando un’ansa sterile, scegliere una colonia con fenotipo coerente con quello delle colonie sperimentali precedenti. Inoculare il THB con la colonia selezionata utilizzando lo stesso tratto d’ansa.

Incubare la piastra con la soluzione THB a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 220 rotazioni al minuto. Questi batteri verranno utilizzati per inoculare la coltura destinata all'infezione sottocutanea dei topi nei passaggi successivi. Posizionare anche la piastra di agar sangue nell'incubatore.

La piastra verrà utilizzata la mattina seguente per confermare che il fenotipo emolitico dei batteri nella soluzione THB corrisponda a quello della colonia inizialmente selezionata. Se il fenotipo emolitico non è coerente con quello del clone originale, non iniziare l'esperimento. Trasferire il topo su una piattaforma e rimuovere il pelo dalla schiena.

Se l'animale è eccessivamente aggressivo, potrebbe essere necessaria una sedazione con isoflurano. Applicare circa cinque millimetri cubi di crema depilatoria, come NA, sulla zona rasata. NA può essere acquistato in una farmacia locale.

Assicurarsi di acquistare la crema depilatoria contenente olio per bambini, poiché il prodotto senza olio per bambini risulterebbe troppo stimolante per i topi. Lasciare agire la crema sulla superficie della pelle per circa un minuto; mentre la crema depilatoria agisce, inumidire alcuni tovaglioli di carta con acqua doppio distillata dopo un minuto. Utilizzare i tovaglioli di carta inumiditi per pulire l'area rasata.

Assicurarsi che la pelle sia priva del prodotto depilatorio. Riscaldare preliminarmente 10 millilitri di THB in un tubo con tappo a vite da 50 millilitri a 37 gradi Celsius in un incubatore batterico per quattro fino a 10 ore. Trasferire 20 microlitri della coltura batterica da incubazione notturna nel THB preriscaldato. Questo diluirà la coltura notturna.

Una sospensione di uno a 500. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius in un incubatore agitato a 220 rotazioni al minuto per circa due ore e mezza fino a tre ore dopo il periodo di incubazione. Utilizzare ulteriore THB per diluire ulteriormente la sospensione batterica a uno a 10 e misurare la sospensione con uno spettrofotometro.

Con assorbanza a 514 nanometri. Continuare a incubare la sospensione a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 rotazioni al minuto fino a quando la sospensione diluita 1:10 non raggiunge un valore di 0,25. Per raccogliere il M er, centrifugare il tubo da 50 millilitri a 3.225 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il soprannatante e risospendere.

Sospendere la coltura batterica in 10 millilitri di DPBS e lavare nuovamente i batteri ripetendo il passaggio di centrifugazione per questo modello di infezione severa. Risospendere il pellet batterico in circa un millilitro di DPBS, ottenendo circa 1 × 10¹⁰ unità formanti colonie per millilitro. Preparare in serie piastre A-R-T-S-A con sangue di pecora, diluire in modo seriale i batteri da 10¹ a 10⁸ in DPBS e seminare.

Gocce da 10 microlitri della sospensione batterica diluita in serie su una piastra di agar sangue in triplice replicato. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo aver incubato le piastre per 16-18 ore, osservare e registrare il fenotipo di emolisi dell'inoculo.

Contare le unità formanti colonie sulle piastre. L'inoculo dell'infezione verrà calcolato in base al numero di unità formanti colonie sulle piastre.

Preparare una siringa con 100 microlitri della sospensione batterica in DPBS preparata in precedenza. Prima dell'iniezione, i topi devono essere sedati in modo che la frequenza respiratoria sia di circa un respiro al secondo. A scopo dimostrativo, in questo video viene mostrato un topo eutanasizzato.

Iniettare il siero M in una fiancata dopo l'iniezione. Riposizionare il topo nella sua gabbia. Osservare gli animali per tre-cinque ore dopo l'iniezione per accertarsi che il topo sia vivo prima del ritorno alla stanza degli animali.

Monitorare quotidianamente le lesioni sul dorso degli animali dopo che gli animali sono stati sacrificati. Misurare e registrare le dimensioni e le condizioni delle lesioni sulla pelle. Le aree delle lesioni cutanee e muscolari vengono quantificate moltiplicando la lunghezza e la larghezza della lesione in millimetri.

Le lesioni di forma irregolare devono essere suddivise in pezzi più piccoli e simmetrici, e ciascun pezzo deve essere misurato con lo stesso metodo. Preparare provette microcentrifuga da 1,5 millilitro con 100 microlitri di DPBS per il prelievo del tessuto. Incidere la pelle con una lametta sterile e asportare la lesione con un paio di forbici sterili.

Quando si asporta la lesione, assicurarsi di asportare anche circa due-cinque millimetri di cute sana circostante la zona. Collocare la lesione nei tubi per il prelievo dei tessuti destinati all'analisi delle lesioni muscolari. Rimuovere con cura la cute per misurare le dimensioni e registrare lo stato della lesione sul tessuto muscolare.

Prelevare la milza e i reni. Posizionare questi tessuti in provette di raccolta separate. Omogeneizzare i tessuti agitando con una siringa da un millilitro per circa 30 secondi.

Aggiungere 900 microlitri di DPBS in ogni provetta. Assemblare le piastre THA e vorticare i campioni di tessuto omogeneizzato per cinque minuti. Diluire in serie il campione.

Le sospensioni vengono diluite da un fattore di 10¹ a un fattore di 10⁶. In piastre a 96 pozzetti, distribuire 10 microlitri di ciascuna sospensione progressivamente diluita sui pozzetti. Incubare le piastre durante la notte in un'incubatrice per batteri a 37 gradi Celsius.

Il mattino seguente, conta le unità formanti colonie dalle piastre e calcola il numero di unità formanti colonie in base ai fattori di diluizione. Se l'infezione viene eseguita correttamente, si osserverà immediatamente dopo l'iniezione sottocutanea una vescica sulla superficie della pelle. Se non si osserva alcuna vescica, l'iniezione potrebbe essere troppo profonda, il che potrebbe influenzare l'esito dell'infezione.

La dimensione della lesione e la sopravvivenza batterica possono essere valutate in diversi momenti successivi all'infezione mediante MSA. Le seguenti lesioni cutanee sono state esaminate al terzo giorno dall'infezione e rappresentano esempi di lesione su un topo CD1 infettato su un fianco con uno per dieci alla sette unità formanti colonie. Le lesioni muscolari si riscontrano tipicamente nel tessuto sottostante le lesioni cutanee.

Di seguito sono riportati esempi di lesioni muscolari superficiali corrispondenti alle foto delle lesioni cutanee mostrate in precedenza. Si tratta di lesioni muscolari osservate al terzo giorno post infezione in un topo infettato con un valore pari a dieci alla settima unità formante colonie. L'area della lesione è determinata come il prodotto tra la lunghezza e la larghezza della lesione, misurata in millimetri, e può essere quantificata per valutare il danno tissutale della pelle.

Il numero di unità formanti colonie dei batteri localizzati nel sito di infezione può essere quantificato su lesioni escisse. Il conteggio delle unità formanti colonie può indicare se un fattore di virulenza conferisce all'MSA un vantaggio di sopravvivenza. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di adottare le normali precauzioni di sicurezza a causa dell'uso di aghi e di microrganismi altamente patogeni dopo aver seguito questa procedura.

Come ultimo modello di ascesso, utilizziamo un'inoculo 1.000 volte inferiore rispetto al nostro modello, che può essere impiegato per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio quali siano i fattori S che favoriscono un'infezione persistente da RSA. Non dimenticare che lavorare con siringhe riempite con un Mars A può essere estremamente pericoloso e che è fondamentale adottare precauzioni, come smaltire la siringa direttamente nel contenitore per materiali taglienti, al fine di evitare punture accidentali dell'ago. Inoltre, per questo esperimento, è importante seguire protocolli standard di BS O2 per garantire una corretta disinfezione dell'area di lavoro.

È tutto qui. Grazie per aver guardato. Ciao. Ciao, arrivederci.