Endocardite modello sperimentale di meticillino resistente

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un modello sperimentale di endocardite infettiva nei ratti. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando aureus e preparando i cateteri chirurgici per l'infezione. Successivamente, si prepara la zona chirurgica e si anestetizza l'animale.

Dopo che l'animale è stato anestetizzato, si inserisce un catetere attraverso l'arteria carotidea destra in direzione del cuore. L'ultimo passaggio consiste nell'inoculare gli animali con aureus mediante iniezione nella vena della coda. Infine, i tessuti bersaglio vengono dissecati e preparati per la coltura quantitativa.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il modello di endocardite rapida, è che il modello di endocardite rossa può essere utilizzato con il sistema di imaging in vivo Ivus. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della patogenesi orale, come la virulenza e l'efficacia degli agenti antimicrobici. In generale, le persone nuove a questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà poiché la procedura chirurgica è complessa.

Prima di tutto, inoculare un’ansa piena di coltura M SSA da una riserva congelata su una piastra di agar sangue di pecora. Incubare la coltura durante la notte a 37 gradi Celsius, assicurandosi che non vi sia contaminazione. Scegliere una singola colonia dalla piastra e utilizzarla per inoculare cinque millilitri di brodo triptoso di soia in un tubo da 15 millilitri con tappo a vite.

Incubare l'inoculo a 37 gradi Celsius durante la notte in un incubatore agitato. Impostare a 200 giri/min per preparare prima i cateteri. Tagliare il tubo di polietilene in pezzi da 10 centimetri e sterilizzare i cateteri in soluzione disinfettante cex per 30 minuti.

Successivamente, fondere un'estremità di una provetta sterilizzata premendo la punta con pinze sterili riscaldate, per creare un catetere che, passando dall'arteria carotidea destra al ventricolo sinistro, provocherà danni all'endocardio quando il cuore batte. Quindi anestetizzare il ratto ponendolo in una camera contenente una miscela uno a uno di isoflurano e ossigeno fino a quando l'anestesia fa effetto. Confermare l'anestesia verificando che i muscoli siano rilassati e che i riflessi plantari siano assenti.

Mantenere uno stato anestetizzato durante l'intervento chirurgico utilizzando un cono nasale collegato alla miscela gassosa. Pulire l'area chirurgica con Betadine ed etanolo al 70% utilizzando una tecnica sterile per tutta la durata dell'intervento. Posizionare il ratto in posizione dorsale ed eseguire un'incisione verticalmente attraverso lo strato cutaneo del collo al di sopra dello sterno mediante dissezione ottusa.

Separare la fascia per esporre l'arteria carotide destra. L'arteria carotide destra si trova appena a destra della linea mediana, sopra le clavicole. Sollevare con attenzione l'arteria dalla cavità del collo e posizionare al di sotto due tratti di sutura in seta lunghi 10 centimetri per legare l'estremità cefalica esposta.

Quindi applicare una pinza sull'arteria per prevenire il sanguinamento. Creare un piccolo foro nella parte superiore dell'arteria utilizzando un introduttore per catetere con pinze. Inserire l'estremità non sigillata del catetere attraverso il foro nell'arteria.

Rimuovere la clip e spingere il catetere verso il cuore. Fino a quando non si incontra resistenza e il catetere è correttamente inserito, esso dovrebbe estendersi di quattro-cinque centimetri all'interno dell'arteria e pulsare al ritmo del battito cardiaco del ratto. Una volta posizionato il catetere, praticare una sutura lenta attorno all'estremità coddle dell'arteria e fissare saldamente il catetere in sede.

Con un filo di seta, tagliare l'eccesso di filo e le estremità del catetere, quindi ripiegare le estremità sotto la pelle del collo. Chiudere la pelle con clip dermatologiche. Posizionare il ratto in una gabbia pulita e mantenerlo in un luogo caldo fino al risveglio dall'anestesia.

Fornire cibo e acqua e controllare frequentemente il ratto, sia durante che dopo il recupero. L'infezione può essere eseguita tra uno e sette giorni dopo l'intervento chirurgico, ma il tempo deve rimanere costante all'interno degli esperimenti. Pulire la coda del ratto con etanolo al 70% e iniettare 0,5 millilitri della coltura di MRSA alla cellula desiderata.

Contare nella vena della coda. Utilizzando un ago da 27 gauge di mezzo pollice, applicare pressione sul sito di iniezione fino a quando l'eventuale sanguinamento si è arrestato, prima di restituire il ratto alla sua gabbia. Dopo l'eutanasia del ratto, pulire il torace con etanolo al 70% e quindi praticare un'incisione a forma di V nel torace al di sotto dello sterno.

Tagliare la cartilagine delle costole su ciascun lato dello sterno. Per esporre il cuore, sollevarlo delicatamente verso l'alto e recidere il tessuto vicino all'aorta, quindi dissezionare verso l'alto per liberare il cuore. Posizionare il cuore in una piastra di Petri sterile foderata con garza da quattro pollici per quattro pollici, quindi praticare un'incisione attraverso la parete interna del ventricolo sinistro e aprire la camera sinistra.

Verificare il corretto posizionamento del catetere, quindi rimuoverlo. Esaminare e rimuovere le vegetazioni dalla valvola con forbici e pinze. Rimuovere anche i reni e la milza, e dopo aver pesato e omogeneizzato i tessuti e le vegetazioni, eseguire diluizioni seriali in PBS per colture quantitative.

Qui è mostrato un catetere posizionato correttamente, come indicato dalla freccia più a sinistra. Il catetere si estende attraverso la valvola aortica e nel lato sinistro della camera cardiaca, e numerose vegetazioni sono visibili intorno alle valvole aortiche, come indicato dalle frecce centrale e di destra. Questa tabella fornisce un esempio della virulenza di un ceppo ssus nel modello di endocardite nel ratto.

Tutti gli animali sfidati con inoculo di 10 alla quinta e 10 alla sesta UFC hanno sviluppato endocardite con elevate densità di ssus nelle vegetazioni cardiache, nonché nei reni e nella milza. Una volta padroneggiata, questa procedura chirurgica può essere eseguita entro 10 minuti se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere l'animale in uno stato valutato durante l'intervento chirurgico e successivamente. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'ivus, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio monitorare in tempo reale l'efficacia degli agenti antimicrobici e l'espressione genica in vivo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica rappresenta la via per i ricercatori nel campo di *Staphylococcus aureus* e della patogenesi per esplorare i fattori di virulenza patogenetica nell'infezione endovascolare.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire un modello sperimentale di endocardite nei ratti. Non dimenticare che lavorare con MRA può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come indossare camice da laboratorio e guanti, durante l'esecuzione di questa procedura.