La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

L'obiettivo generale di questa procedura è creare embrioni chimerici trapiantando l'ectoderma da embrioni donatori nella mascella superiore in via di sviluppo di embrioni di pollo. Questo viene realizzato innanzitutto rimuovendo l'ectoderma donatore per il trapianto. Successivamente, il sito ospite viene preparato per l'innesto.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nel posizionare il tessuto donatore sul sito ospite e fissare innesto in sede. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'innesto esclusivo dell'ectoderma donatore e, attraverso analisi molecolari e morfologiche, è possibile determinare la funzione del derma ricostituito del donatore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo, come l'identificazione del ruolo di vari tessuti durante la morfogenesi.

La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Diane, un'investigatrice senior del nostro laboratorio. Prima di iniziare questa procedura, preparare i mezzi e assicurarsi che tutte le soluzioni necessarie siano disponibili e alla temperatura corretta. Successivamente, indossando un'adeguata protezione oculare, tirare le micropipette capillari fino a formare una punta fine sopra una fiamma di alcol.

Per realizzare perni di vetro, affilare le punte di tungsteno tenendole nella fiamma di una torcia a propano. Iniziare l'estrazione dell'embrione donatore dal guscio posizionando un pezzo di nastro adesivo su una estremità dell'uovo. Quindi utilizzare la punta di un ago da dissezione per creare un piccolo foro al centro del nastro.

Inserire una siringa da 10 millilitri e un ago ipodermico da 18 gauge nel foro ed estrarre un millilitro di albume dall'uovo. Quindi, utilizzando un ago da dissezione, praticare un piccolo foro nella parte superiore del guscio. Apporre un secondo pezzo di nastro per coprire questo foro.

Praticare un'apertura circolare nell'uovo utilizzando due paia di pinzette. Afferrare l'embrione e posizionarlo in una piastra contenente PBS ghiacciato per il lavaggio. Dopo aver rimosso la testa dell'embrione, collocarla in una piastra per colture cellulari contenente DMEM senza siero a temperatura ambiente.

Posizionare la piastra sotto il microscopio stereoscopico tenendo la testa con una pinzetta. Utilizzare forbici a molla per dissezionare grossolanamente la mascella superiore e il lagon dal resto della testa. Successivamente, utilizzando un portalametta con una lama di rasoio affilata, rimuovere il processo nasale frontale dalla mascella superiore.

Utilizzare una pipetta per trasferire il processo nasale frontonale in una piastra Petri da 30 millimetri contenente un volume sufficiente di diss in PBS e incubare sul ghiaccio per 20 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare la soluzione dispa senza disturbare il tessuto. Quindi coprire completamente i tessuti con DMEM contenente 1% BSA.

Per arrestare la digestione, trasferire il tessuto in una nuova piastra di coltura. Quindi, lavorando al microscopio stereoscopico, tenere il tessuto con un ago di tungsteno non affilato utilizzando un ago di tungsteno affilato.

Separare l'ectoderma staccandolo dagli altri tessuti. Una volta preparato, conservare il tessuto da trapiantare in DMEM con BSA su ghiaccio fino a quando l'ospite non sarà pronto per il trapianto. Utilizzando il metodo precedentemente dimostrato, creare una finestra nell'uovo di pollo.

Posizionare l'uovo contenente l'embrione sotto il microscopio stereoscopico utilizzando due paia di pinzette. Afferrare la membrana IGN e l'amnios e strappare delicatamente per creare un'apertura ed esporre l'embrione ospite. Ruotare la testa posizionando un paio di pinzette sull'occhio destro ed esercitando pressione mentre si tiene ferma la testa.

Utilizzare un paio di pinze e un ago per rimuovere il derma dell'ospite al fine di accogliere l'innesto. Aggiungere due microlitri di rosso neutro alla piastra di Petri contenente gli innesti preparati. Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire l'innesto nell'ospite.

Posizionare l'innesto al posto dell'ectoderma rimosso. Inserire un perno di vetro in ogni angolo del tessuto innestato per fissare l'innesto in posizione dopo l'innesto. Chiudere accuratamente la finestra con del nastro adesivo.

Riportare l'embrione nell'incubatrice fino allo stadio di sviluppo richiesto per l'analisi; questa immagine mostra un tessuto proveniente da un embrione di quaglia URA che è stato colorato con un anticorpo specifico per la quaglia anti Q-C-P-N-A. Il tessuto trapiantato si trova tra le due frecce. Non vi è evidenza di colorazione QCPN nel tessuto di tipo selvatico proveniente da un chimera topo-quaglia qui mostrato. Ancora una volta, il tessuto trapiantato si trova tra le due frecce in C, ibridazione con una sonda specifica per la sequenza ripetitiva segnale B due.

L'analisi dei geni della classe uno rivela che l'espressione del marcatore B due è limitata all'ome che comprende l'innesto mostrato qui come immagine di un chimera quaglia-pulcino, colorata con la tecnica della tri-cromatura che rende il collagene e l'osso di colore blu. La duplicazione dello scheletro della mascella superiore è visibile come indicato dalla freccia. Questa immagine mostra una chimera topo-pulcino, nuovamente colorata con la tecnica della tri-cromatura.

Si osserva una duplicazione dello scheletro della mascella superiore. Questa immagine mostra l'ibridazione radioattiva in situ dell'espressione normale di BMP7 nel mesenchima di un embrione di pollo trapiantato, mostrato qui come tessuto proveniente da un chimera topo-pollo. È possibile osservare che l'espressione di BMP7 è indotta nel mesenchima adiacente al trapianto, come indicato dalla freccia.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare embrioni di pollo per valutare i meccanismi che regolano lo sviluppo della regione frontale e del processo nasale.