Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio
20 gennaio 2013
Il mesenchima cranica subisce movimenti morfogenetici drammatici che fornisce probabilmente una forza trainante per l'elevazione delle pieghe neurali 1,2. Qui descriviamo un semplice Ex vivo Espianto saggio per caratterizzare i comportamenti cellulari del mesenchima cranica durante neurulazione. Questo saggio ha numerose applicazioni tra cui essere suscettibili di manipolazioni farmacologiche e analisi di imaging dal vivo.
Lo scopo di questa procedura è monitorare il comportamento della coltura primaria cranica. In condizioni di coltura definite. Il primo passaggio consiste nel prelevare le corna uterine da un topo gravido a tempo determinato.
8,5 giorni post coito. Una volta isolati, gli embrioni vengono rimossi dalla decidua e il sacco vitellino viene asportato per il genotipaggio. Successivamente, i piatti meccanici cranici vengono microdissecati e trasferiti in piastre di coltura tessutale rivestite con matrice extracellulare.
Si lasciano aderire gli espianti X e vengono coltivati fino a 48 ore in presenza o assenza di specifici agenti farmacologici. Infine, vengono acquisite immagini degli espianti per mostrare le differenze nella migrazione cellulare. Questo metodo è utile per rispondere a domande fondamentali, come ad esempio quali sono le vie di segnalazione e le proteine della matrice extracellulare coinvolte e che controllano il comportamento del cran durante l'elevazione del solco neurale.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché i passaggi della microdissezione sono difficili da apprendere e richiedono pazienza e pratica per essere padroneggiati. Per iniziare, se si eseguirà un'immunocitochimica, preparare i coprioggetti; altrimenti, saltare questo passaggio e rivestire direttamente le piastre per colture cellulari con coprioggetti circolari in vetro sterili da 12 millimetri, immergendoli nell'etanolo. Lasciarli asciugare all'aria. Successivamente, posizionare un coprioggetto sterile in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
Lavorare in una cappa a flusso laminare, utilizzando un millilitro di matrice extracellulare o ECM per ricoprire i coverslip o il fondo di una piastra per colture cellulari. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore; al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di ECM e lavare tre volte con PBS. A questo punto, le piastre ricoperte possono essere utilizzate immediatamente oppure avvolte e conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane.
Ade nella visualizzazione dell'embrione traslucido. Preparare lastre di Syl con fondi neri resistenti. Seguire il protocollo del produttore.
Preparare gli strumenti per la dissezione inserendo un ago minutian in un supporto per aghi. Utilizzare una pietra per affilare per affilare la pinzetta quando tutto è pronto. Raccogliere l'utero da un topo gravido a tempo determinato che si trova a 8,5 giorni post quot.
Posizionare l'utero isolato in una piastra contenente PBS sterile e lavare. Una volta sotto un microscopio per dissezione, separare le singole decidue utilizzando forbici e pinzette. Rimuovere il tessuto connettivo uterino con un movimento di strappo, avendo cura di non esercitare pressione e far fuoriuscire l'embrione dalla decidua.
Utilizzare la pinzetta per strappare con attenzione il tessuto uterino dal lato opposto alla placenta. Per esporre l'embrione racchiuso nel sacco vitellino, usare la pinzetta per afferrare l'embrione e il sacco vitellino dalla placenta ed eliminare il tessuto uterino dalla piastra. Successivamente, utilizzando la pinzetta per strappare delicatamente, rimuovere il sacco vitellino dall'embrione.
Posizionare il sacco vitellino in una provetta eppendorf per il genotipaggio utilizzando una pipetta, una volta isolato lo stadio dell'embrione contando i somiti. Idealmente, l'embrione sarà compreso tra lo stadio sei e dieci somiti. A questo stadio, i solchi neurali stanno appena iniziando ad alzarsi e la principale morfogenesi del mesenchima cranico non si è ancora verificata.
Dopo aver determinato lo stadio, trasferire l'embrione su una piastra nera per cellule contenente DMEM senza rosso fenolo. Innanzitutto, utilizzando un microscopio stereoscopico con l'ingrandimento più elevato possibile, focalizzare la testa dell'embrione con un ago da dissezione in ciascuna mano e dissezionare la testa anteriormente alle rmba meres. Successivamente, effettuare un taglio lungo la linea mediana per bi.
Dissezionare la testa in due metà uguali utilizzando un ago da dissezione in ciascuna mano. Dissezionare i bordi esterni lungo il margine della testa dell'embrione e lungo la linea mediana. Rimuovere, se necessario, per evitare di confondere l'espian desiderato con tessuto indesiderato.
Il disco esplantato conterrà cresta neurale cranica migratoria, mesoderma parassiale ed ectoderma di superficie, per rimuovere le cellule debolmente aderenti. Pipettare delicatamente su e giù con una punta da 200 microlitri. Per Pepin, raccogliere con attenzione l'esplantato con una punta di pipetta.
In circa 10 microlitri di DMEM posizionati al centro di una camera da coltura rivestita, aggiungere 20 microlitri di DMEM caldo integrato con il 15% di FBS; quindi la piastra da coltura può essere trasferita nell'incubatore per colture cellulari. Dopo circa una o due ore, l'espianterato sarà attaccato e si potrà aggiungere un ulteriore quantitativo di 250 microlitri di mezzo. Dopo circa 24 ore, l'espianterato sarà saldamente aderito al coprislips.
In questo momento, dopo ulteriori 24 ore è possibile aggiungere agenti farmacologici al mezzo; le cellule migreranno dai tessuti. Di norma, vengono acquisite immagini per documentare la distanza e il numero di cellule migrate dai tessuti. A questo punto, poiché i tessuti cominciano a mostrare segni di ridotta vitalità con incubazioni più prolungate, si osserva.
Di seguito sono riportati esempi di cellule che migrano da preparati di mesoderma cranico e da piante di chix. Dopo 48 ore su diversi substrati, sia la forma che la dimensione delle cellule provenienti dall'espianto risultano dipendenti dal substrato. La migrazione cellulare è stata valutata su fibronectina, laminina, gel di matrice extracellulare (ECM), gel max e acido ialuronico.
Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'immunofluorescenza e l'imaging in tempo reale possono essere utilizzati per approfondire lo studio dei percorsi che regolano il comportamento delle cellule della cresta neurale cranica durante l'elevazione del solco neurale.
Panoramica
Questo studio presenta un semplice saggio ex vivo con espianti per analizzare i comportamenti cellulari del mesenchima cranico durante la neurulazione. Il saggio consente manipolazioni farmacologiche e analisi mediante imaging in tempo reale, fornendo informazioni sui movimenti morfogenetici che portano all'elevazione delle pieghe neurali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Biologia cellulare
Sfondo
- Il mesenchima cranico svolge un ruolo fondamentale nell'elevazione delle pieghe neurali.
- Comprendere i comportamenti cellulari durante la neurulazione è essenziale per la biologia dello sviluppo.
- Assay ex vivo possono fornire informazioni preziose sulle dinamiche cellulari.
- Agenti farmacologici possono essere utilizzati per manipolare e osservare questi comportamenti.
Scopo dello studio
- Caratterizzare i comportamenti cellulari del mesenchima cranico durante la neurulazione.
- Sviluppare un saggio utilizzabile per studi farmacologici e di imaging.
- Esplorare i percorsi di segnalazione e le proteine della matrice extracellulare coinvolti nel comportamento del mesenchima cranico.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di embrioni da topi gravidi a tempo controllato.
- Microdissezione di espianti di mesenchima cranico.
- Coltura degli espianti su piastre rivestite con matrice extracellulare.
- Acquisizione di immagini in tempo reale per monitorare la migrazione e il comportamento cellulare.
Risultati principali
- Allegamento e coltura riusciti di espianti di mesenchima cranico.
- Osservazione dei modelli di migrazione cellulare influenzati dalla composizione del substrato.
- Identificazione delle principali vie di segnalazione coinvolte nell'elevazione delle pieghe neurali.
- Dimostrazione dell'utilità del saggio per studi farmacologici.
Conclusioni
- Il saggio ex vivo con espianti è uno strumento prezioso per lo studio della dinamica del mesenchima cranico.
- Manipolazioni farmacologiche possono fornire informazioni sui comportamenti cellulari durante la neurulazione.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sui processi dello sviluppo e sui disturbi ad essi correlati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio su espianti ex vivo consente un'analisi meccanicistica dei comportamenti del mesenchima cranico durante la neurulazione, supportando la validazione di bersagli in percorsi dello sviluppo. Quantificando la migrazione cellulare su substrati di matrice extracellulare definiti, fornisce un'elevata affidabilità predittiva per ridurre i rischi associati a ipotesi sui fattori morfogenetici della formazione del tubo neurale. La compatibilità del saggio con perturbazioni farmacologiche e con l'immagineggiamento in tempo reale lo posiziona come un ponte traslazionale tra la biologia della scoperta e la modellizzazione preclinica dei processi neurosviluppali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche isolando il mesenchima cranico per chiarire i contributi specifici dei percorsi all'elevazione della piega neurale.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante la validazione funzionale dei comportamenti delle cellule mesenchimali in un sistema rilevante per la malattia.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando le interazioni tra cellule e matrice extracellulare a fenotipi migratori che informano sul livello di affidabilità del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, standardizzando l'adesione degli espanti e le letture della migrazione.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio mediante condizioni di coltura definite e output quantitativi su fibronectina, laminina, Matrigel, ECM e acido ialuronico.
- Valore strategico: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma per valutare gli effetti dei composti sulla dinamica della migrazione mesenchimale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza per le malattie attraverso il collegamento con difetti della neurulazione e il potenziale traslazionale di biomarcatori nelle popolazioni cellulari migratorie.
- Valore operativo: Descrive un percorso continuo, dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo l’imaging in tempo reale e l’analisi farmacologica dei percorsi di segnalazione.
- Valore predittivo: Affronta decisioni di avanzamento corrette rispetto al rischio misurando i comportamenti cellulari che prevedono gli esiti morfogenetici nella chiusura del tubo neurale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla Fase Iniziale di Scoperta all'Identificazione del Compound Guida, sostenendo la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nelle linee guida di biologia dello sviluppo.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi isolando il mesenchima cranico per analizzare le vie di segnalazione responsabili dei riarrangiamenti mesenchimali.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio mediante colture esplantate standardizzate su piastre rivestite con matrice extracellulare e misurazione quantitativa della distanza e del numero di cellule migratorie.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni come il conteggio delle cellule migratorie e i cambiamenti morfologici, che permettono il confronto tra diverse condizioni in presenza di variabili farmacologiche o di substrato.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica consentendo studi con imaging in tempo reale e approfondimenti farmacologici utili a modellare difetti della neurulazione.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per lo studio delle interazioni mesenchima-matrice extracellulare in diversi contesti di sviluppo neurologico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella morfogenesi mesenchimale.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei saggi con espianti su substrati ECM definiti.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi di neurosviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate su fenotipi quantitativi di migrazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in tecniche di dissezione embriologica e microdissezione.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche per l'acquisizione di immagini in tempo reale e la gestione di composti farmacologici.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per la preparazione degli espianti e la coerenza del rivestimento della matrice extracellulare (ECM).
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello a causa della composizione mesenchimale e dello stadio embriologico specifici della specie.
- Limitazioni pratiche, inclusa la vitalità del tessuto oltre le 48 ore e la dipendenza da uno stadio preciso degli somiti embrionali.
