Efficiente polietilene glicole (PEG) Trasformazione mediata della Moss Physcomitrella patene
19 aprile 2011
Un metodo semplice ed efficace per trasformare Physcomitrella pantens Protoplasti è descritto. Questo metodo è adattato da protocolli per Physocmitrella Protonemal protoplasti e Arabidopsis Mesofillo trasformazione di protoplasti 1.
L'obiettivo generale di questa procedura è trasformare i protoplasti di SCO Metre. Questo viene ottenuto innanzitutto digerendo le piante con Drizly. Successivamente, i protoplasti vengono lavati con mannitolo per rimuovere il Drizly e quindi incubati con DNA e PEG.
Infine, i protoplasti trasformati vengono seminati su piastre e incubati. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano protoplasti trasformati che esprimono proteine marcate con fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza. A dimostrare la procedura sarà Y. Lu, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che è efficace e genera in modo costante protoplasti che esprimono la proteina di interesse. Per isolare i protoplasti di muschio, iniziare aggiungendo nove millilitri di mannitolo all'8% in una piastra di Petri utilizzando una spatola. Aggiungere muschio di cinque o sette giorni di età proveniente da due o tre piastre PP NH4 nel mannitolo. Si prega di consultare il protocollo scritto allegato per questo e ulteriori ricette dei reagenti. Successivamente, aggiungere tre millilitri di Drizly al 2% e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per un'ora.
Filtrare la miscela attraverso una maglia da 100 micron per ottenere una sospensione verde omogenea. Successivamente, centrifugare il filtrato a 250 G per cinque minuti. Scartare con molta delicatezza il soprannatante.
Risospendere i protoplasti in 500 microlitri di mannitolo all'8%. Quindi aggiungere ulteriori 9,5 millilitri di mannitolo all'8%. Assicurarsi che i protoplasti siano completamente risospesi.
Eseguire altri due passaggi di lavaggio centrifugando nuovamente la soluzione a 250 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere i protoplasti, prima in 500 microlitri.
Quindi, 9,5 millilitri di mannitolo all'8% utilizzando un citometro ematico. Contare il numero di protoplasti in 10 microlitri della sospensione per trasformare il DNA nei protoplasti isolati. Per prima cosa, centrifugare la miscela di protoplasti a 250 G per cinque minuti.
Rimuovere il soprannatante e risospendere i protoplasti a 1,6 milioni per millilitro in soluzione MMG. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, aggiungere 600 microlitri della soluzione di protoplasti in un tubo da coltura contenente 60 microgrammi di DNA. Agitare.
Aggiungere delicatamente 700 microlitri di soluzione di calcio PEG e agitare. Incubare bene il campione a temperatura ambiente per 30 minuti durante questo periodo di attesa. Coprire le piastre PRMB con carta trasparente.
Quindi diluire la sospensione con tre millilitri di soluzione W5 e centrifugare a 250 ×g per cinque minuti. Per rimuovere il PEG, risospendere i protoplasti in due millilitri di PRMT e piastrare un millilitro per piastra PRMB coperta con carta da forno. Mantenere le piastre a 25 gradi Celsius in una camera di crescita.
Infine, quattro giorni dopo la trasformazione, trasferire la pellicola di cellophane su piastre di selezione fresche. Questa figura mostra un esempio di piante di 18 giorni rigenerate da protoplasti, trasformati con 15 microgrammi di DNA plasmidico superavvolto, contenente un cassetto di resistenza all'igromicina. In questo caso, 30 microgrammi dello stesso plasmide superavvolto, DNA, sono stati trasformati nei protoplasti.
60 microgrammi di DNA plasmidico sono stati trasformati in questo campione. E infine, queste piante sono state rigenerate da protoplasti che sono stati trasformati con 120 microgrammi dello stesso DNA plasmidico in forma superavvolta, contenente la cassetta di resistenza all'igromicina. L'efficienza di trasformazione non è influenzata da concentrazioni di DNA fino a 60 microgrammi.
Tuttavia, concentrazioni più elevate di DNA sono dannose per questa procedura. I dati indicano che questo metodo fornisce risultati costanti su un'ampia gamma di quantità di DNA Una volta semestre. Questa tecnica può essere eseguita in tre ore se viene effettuata correttamente.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori metodi come l'RNAi transitorio e gli knockout genici per rispondere ad altre domande riguardo alla funzione genica.
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo semplice ed efficiente per la trasformazione di protoplasti di Physcomitrella patens. La tecnica è adattata da protocolli esistenti per la trasformazione di protoplasti e mira a produrre risultati costantemente efficaci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Ingegneria genetica
- Biologia cellulare
Sfondo
- I protoplasti sono cellule vegetali prive della parete cellulare.
- Le tecniche di trasformazione sono essenziali per lo studio della funzione genica nelle piante.
- Physcomitrella patens è utilizzato come organismo modello nella ricerca vegetale.
- I metodi esistenti per la trasformazione dei protoplasti possono risultare complessi e dispendiosi in termini di tempo.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo semplificato per la trasformazione di protoplasti di Physcomitrella patens.
- Migliorare l'efficienza e l'affidabilità della trasformazione dei protoplasti.
- Facilitare ulteriori studi genetici nel muschio.
Metodi Utilizzati
- Digerire il tessuto di muschio con Drizly per isolare i protoplasti.
- Lavare i protoplasti con mannitolo per rimuovere i contaminanti.
- Trasformare i protoplasti isolati con DNA utilizzando PEG.
- Incubare i protoplasti trasformati su terreno selettivo.
Risultati principali
- I protoplasti trasformati hanno espresso con successo proteine fluorescenti.
- Il metodo ha mostrato un'efficienza di trasformazione costante a diverse concentrazioni di DNA.
- Concentrazioni elevate di DNA si sono rivelate dannose per il successo della trasformazione.
- L'intera procedura può essere completata in circa tre ore.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per la trasformazione di protoplasti di Physcomitrella patens.
- Permette esperimenti successivi come l'RNAi transitorio e gli knockout genici.
- Il protocollo può contribuire in modo significativo alla comprensione della funzione genica nei muschi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La trasformazione mediata da PEG di protoplasti di Physcomitrella patens consente un trasferimento genico efficiente e riproducibile, supportando la genomica funzionale ad alto rendimento nei sistemi vegetali. Questa capacità è fondamentale per i team di scoperta iniziale che intendono analizzare la funzione genica, validare bersagli e accelerare l'elucidazione dei percorsi metabolici in un modello geneticamente accessibile. La scalabilità del metodo e il suo potenziale di standardizzazione lo rendono prezioso per schermate genetiche su larga scala e per la riduzione del rischio meccanicistico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un'analisi rapida della funzione genica mediante un efficiente trasferimento di DNA nelle cellule di muschio.
- Permette un'elevata frequenza di targeting genico per la validazione funzionale delle proteine bersaglio e l'analisi dei percorsi metabolici.
- Semplifica la riduzione dei rischi meccanicistici consentendo modifiche genetiche precise in un sistema modello.
- Migliora l'affidabilità predittiva delle ipotesi biologiche successive.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un protocollo standardizzato per la generazione di un elevato numero di trasformanti da utilizzare in saggi di screening.
- Garantisce un'efficienza di trasformazione riproducibile, favorendo l'affidabilità e la scalabilità dei saggi.
- Consente la preparazione di sistemi biologici validati per la valutazione di composti e lo screening fenotipico.
- Riduce la dipendenza da attrezzature specializzate, aumentando l'accessibilità per i team impegnati nello sviluppo di saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Consente applicazioni successive come studi di silenziamento transitorio dell'RNA e di knockout genico, rilevanti per la modellizzazione delle malattie.
- Permette un percorso continuo dalla scoperta genica alla validazione preclinica in sistemi a base vegetale.
- Fornisce una piattaforma per l'esplorazione di biomarcatori traslazionali quando abbinata a vie biologiche rilevanti per le malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di trasformazione si inserisce nel percorso che va dalla scoperta iniziale all'identificazione del capostipite, consentendo la manipolazione genetica, la validazione del bersaglio e lo sviluppo di saggi nei modelli vegetali.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici mediante un'efficace consegna genica e l'analisi dell'espressione genica.
- Screening: Supporta la preparazione e la riproducibilità dei saggi generando popolazioni di trasformanti costanti.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi come l'efficienza di trasformazione e l'espressione proteica per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Permette studi genetici che contribuiscono allo sviluppo di modelli preclinici e all'identificazione di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità di trasformazione standardizzata e ampiamente applicabile per svariati studi genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla funzione genica.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità nei flussi di lavoro di trasformazione genetica.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo la generazione di dati robusti nelle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l' avanzamento dei bersagli genetici e dei percorsi, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare vegetale e nella tecnica asettica per l'isolamento e la trasformazione di protoplasti.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture di laboratorio di base, inclusi centrifugazione e microscopia a fluorescenza per la validazione dei risultati.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di trasformazione per garantire la riproducibilità tra progetti.
- Potrebbe richiedere adattamenti per essere utilizzato in altre specie vegetali o sistemi modello diversi da Physcomitrella patens.
- L'efficienza di trasformazione è sensibile alla concentrazione del DNA, con quantità elevate che possono risultare dannose.
