Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare le variazioni nella concentrazione di calcio mitocondriale in cellule vive. Questo viene ottenuto trasfettando prima le cellule con la proteina indicatore di calcio peram a rapporto metrico, indirizzata alla matrice mitocondriale, uno o due giorni dopo la trasfezione. Il microscopio a fluorescenza e il software vengono configurati per l'acquisizione di immagini in tempo reale su cellule vive.

Le immagini di cellule esprimenti un indicatore raziometrico vengono quindi acquisite dopo l'aggiunta di un agonista che mobilita il calcio. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analisi quantitativa delle immagini acquisite. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni dinamiche della concentrazione mitocondriale di calcio mediante microscopia a fluorescenza di cellule vive che esprimono una proteina indicatrice raziometrica del calcio.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione dei livelli di calcio mediante indicatori sintetici del calcio, è che il peram metrico è codificato geneticamente e può quindi essere indirizzato ai mitocondri o a qualsiasi altro organulo di interesse. Salve, sono la dottoressa Ascar, ricercatrice postdottorato nel laboratorio del dottor Benning, e oggi illustrerò la procedura. Per iniziare il protocollo, il giorno precedente la trasfezione si piastrano le cellule HeLa su coprivetri sterili posizionati in una piastra da coltura standard a sei pozzetti, a una densità tale da raggiungere circa il 70% di confluenza al momento della trasfezione il giorno successivo. Il giorno seguente, si preparano i complessi di DNA con Lipofectamine 2000 seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando quattro microgrammi del vettore di espressione mitocondriale del peram metrico e 10 microlitri di Lipofectamine 2000 diluiti in 0,5 millilitri di OPTI-MEM per ciascun pozzetto da trasfettare.

Successivamente, sostituire il terreno di coltura D-M-E-M-F-B-S HELOC in ogni pozzetto con 1,5 millilitri dello stesso terreno senza antibiotici. Aggiungere la soluzione LIPECTOMY alla soluzione di DNA e mescolare delicatamente dopo la formazione dei complessi. Aggiungere la soluzione di DNA Lipectomy goccia a goccia in ogni pozzetto da trasfettare, mescolando delicatamente oscillando la piastra, e incubare per quattro ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, al termine dell'incubazione.

Sostituire il mezzo con D-M-E-M-F-B-S contenente antibiotici. Lasciare che le cellule esprimano metric peram per uno o due giorni prima dell'acquisizione delle immagini utilizzando pinzette. Posizionare delicatamente un coprioggetto con cellule HELOC in una camera di acquisizione adeguata contenente soluzione per imaging.

Montare la camera di imaging sul palco del microscopio invertito. Successivamente, utilizzare un obiettivo ad immersione in olio 40x o superiore e una lunghezza d'onda di 380 nanometri. Per individuare un'area di interesse contenente una o più cellule che esprimono peram metrico, qui si utilizza 380 nanometri per identificare le cellule come metriche in rapporto.

Peram è meno resistente al fotoblecamento a questa lunghezza d'onda. Una volta identificata un'area di interesse, configurare il software per l'eccitazione duale a 495 e 380 nanometri. Successivamente, acquisire le immagini in modo sequenziale eccitando alternativamente a 495 e 380 nanometri.

Acquisire immagini dei livelli di calcio basali per almeno 30 secondi prima dell'applicazione dell'agonista. Successivamente, applicare l'agonista mobilizzatore del calcio tramite un apparato di perfusione, annotando il tempo di aggiunta; i tempi di esposizione all'agonista e gli intervalli di acquisizione devono essere ottimizzati per prevenire il fotoblecamento, pur mantenendo una risoluzione temporale sufficiente. Al termine dell'esperimento, le immagini possono essere analizzate in modalità offline.

Per iniziare l'analisi, selezionare una regione di interesse all'interno di un'area vuota del campo per sottrarre la fluorescenza di fondo, se necessario. Successivamente, esportare le misurazioni del rapporto 4 95 3 80 dalla regione di interesse in Excel o in un software simile per la creazione di grafici. Questo pannello di immagini mostra la localizzazione subcellulare del peram metrico e dei mitocondri.

A sinistra è mostrata un'immagine di cellule vive di cellule HeLa che esprimono Peram a rapporto metrico. Al centro è visibile la colorazione fluorescente dei mitocondri con il colorante selettivo MitoTracker Red CMXRos. Infine, a destra, l'immagine sovrapposta mostrata qui è una serie di immagini a rapporto pseudocolore 495/380 nanometri di quattro cellule HeLa che esprimono Peram a rapporto metrico nei mitocondri, trattate con 10 micromolare di ATP; la quantificazione delle variazioni nei livelli di calcio mitocondriale di quelle quattro cellule precedenti è mostrata in questa immagine di una cellula HeLa che esprime Peram a rapporto metrico nei mitocondri.

È evidente un'eterogeneità della risposta al calcio nei singoli mitocondri, nonché una significativa frammentazione dei mitocondri, già a 60 minuti di trattamento con 0,5 micromolare di storporina. Alcuni mitocondri mostrano aumenti oscillatori del calcio, indicati dalla freccia bianca, mentre altri non mostrano variazioni significative nei livelli di calcio, indicati dalla freccia gialla. Questo grafico mostra la variazione dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula HELO dopo l'induzione dell'apoptosi per 120 minuti con 0,5 micromolare di storporina.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare i cambiamenti dinamici nei livelli di calcio mitocondriale in risposta a vari tli utilizzando la proteina mediata dal calcio R geometric peram, che è indirizzata in modo selettivo alla matrice mitocondriale.