Monitoraggio spaccati Caspase-3 Attività e apoptosi di cellule oligodendrogliali Immortalata dal vivo utilizzando cellule Imaging e Cleaveable fluorogenici-dye seguenti supporti di potassio indotta depolarizzazione della membrana

Questa procedura permette di monitorare in tempo reale la morte cellulare gliale indotta da oligo DDR. Ciò viene ottenuto coltivando prima le cellule, quindi preparandole per l'immagine in tempo reale. Il passaggio successivo consiste nell'applicare un trattamento alle cellule e monitorarne gli effetti mediante microscopia a fluorescenza.

L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire l'analisi dei dati. In definitiva, i risultati mostrano i tassi di morte cellulare in una popolazione cellulare dopo un trattamento o uno stimolo, monitorando la fluorescenza nucleare derivante da un colorante fluorimetrico attivato dalle caspasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione immunoistochimica, è la capacità di raccogliere contemporaneamente più punti temporali.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia cellulare, come le risposte a trattamenti farmacologici, con reagenti e di varia natura. Attualmente, questo metodo può fornire informazioni sulla morte cellulare all'interno di colture cellulari. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come tessuti organotipici ex vivo, inclusi fetti di tessuto cerebrale.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà mentre si adattano a lavorare con tessuti vivi piuttosto che con tessuti fissati. Una dimostrazione visiva di questa tecnica è importante poiché ci sono molti passaggi da eseguire per preparare campioni di cellule vive rispetto ai tessuti fissati. Scongelare innanzitutto le cellule gliali oligodendrocitarie immortalizzate N 19 in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius mentre le cellule si stanno scongelando.

Aggiungere sette millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina in una piastra da coltura da 10 centimetri. Quindi aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia sulla piastra e agitare delicatamente la capsula di Petri per distribuire uniformemente le cellule. Coltivare le cellule a 34 gradi Celsius in un incubatore con il 5% di anidride carbonica per quattro ore dopo quattro ore.

Aspirare il mezzo dalle piastre per rimuovere qualsiasi residuo di DMSO.Crioprotettante. Sostituire con sette millilitri di mezzo fresco dopo quattro a sette giorni di crescita. Quando le cellule hanno raggiunto una confluenza del 70-80%, aspirare il mezzo e pipettare un millilitro di trypsinina sulla pellicola cellulare, incubando a temperatura ambiente per cinque minuti.

Quindi raccogliere le cellule e seminare in una piastra per coltura tissutale da 10 centimetri con le cellule raccolte a una densità di 0,1 volte 10 alla sesta cellule per millilitro, e posizionare questa piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo un ulteriore passaggio, le cellule possono essere seminate per esperimenti di imaging su cellule vive. A tal fine, raccogliere le cellule come in precedenza, quindi prelevare 30 microlitri della sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Successivamente, utilizzare pinzette sterili per posizionare copriletto in vetro non rivestiti. In ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, aggiungere le cellule a una densità di 0,1 × 10⁶ cellule per millilitro. In due millilitri di terreno DMEM ad alto contenuto di glucosio, privo di fenolo, integrato con 10% di FBS e 1% di penicillina-streptomicina, lasciare crescere le cellule durante la notte a 34 °C e 5% di anidride carbonica prima della trasfezione.

Il giorno successivo, combinare 100 microlitri di mezzo privo di siero con da 0,5 a quattro microgrammi di plasmide purificato, DNA e quattro microlitri di FU gene hd. Vortexare delicatamente la miscela due volte, quindi lasciare che il DNA formi complessi a temperatura ambiente per cinque minuti. Trascorso il tempo di incubazione, aggiungere direttamente la miscela di DNA FU gene HD alle cellule in coltura.

Inclinare delicatamente la piastra per mescolare. Quindi coltivare le cellule per ulteriori 48 ore a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima del trattamento o dell'esperimento. Accendere innanzitutto il blocco di controllo dello strumento per cellule vive LCI Cham light.

Questa operazione deve essere eseguita tre ore prima dell'inizio dell'esperimento per garantire un riscaldamento completo della piastra. Al minimo, la scatola di controllo deve essere accesa un'ora prima dell'inizio dell'esperimento. Successivamente, lavorando in una cappa a flusso laminare, spruzzare la camera di coltura magnetica di tipo LCI Cham light e le pinzette con etanolo al 70% e lasciarle asciugare per cinque minuti.

Rimuovere le cellule dall'incubatore ed esaminarle al microscopio per confermare che siano sane. Le cellule dovrebbero apparire duranti e ben espanse sul vetrino di copertura, con numerosi prolungamenti della membrana. Le cellule con un numero ridotto di prolungamenti o con un nucleo di forma irregolare sono probabilmente stressate a causa della trasfezione e non sono adatte per ulteriori esperimenti da eseguire nella cappa a flusso laminare.

Inclinare la piastra a sei pozzetti ed estrarre il cover slip con le pinzette. Posizionare rapidamente il cover slip con il lato delle cellule rivolto verso l'alto nel fondo della camera. Non permettere al cover slip di asciugarsi.

Successivamente, fissare il corpo principale magnetico della camera di coltura e aggiungere 500 microlitri di mezzo proveniente dalla piastra a sei pozzetti originale sulla superficie del vetrino. Il riutilizzo del mezzo riduce lo stress imposto alle cellule a causa dei cambiamenti ambientali e può inoltre essere utile per valutare i fattori secreti extracellulari. Dopo aver aggiunto il mezzo, posizionare il coperchio in vetro sulla camera di coltura e utilizzare una striscia di salviette Kim inumidite al 70% per rimuovere eventuali residui che potrebbero interferire con la microscopia dalla parte inferiore del vetrino.

Posizionare la camera di coltura nell'incubatrice a 34 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Questo passaggio garantirà che la camera stessa si riscaldi a 34 gradi, riducendo lo spostamento del coprivetrino. Mentre il metallo si riscalda, è necessario eseguire i passaggi successivi con l'illuminazione ambiente della stanza ridotta al minimo.

Per prima cosa, Thora in precedenza ha preparato l'acqua elettricamente pura della vista nucleare a temperatura ambiente. Successivamente, prelevare la camera di coltura dall'incubatrice e posizionarla rapidamente nella camera ambientale del microscopio. Accendere la bombola di anidride carbonica al 5% pre-miscelata con doppio regolatore.

Successivamente, utilizzare l'obiettivo 10x con la lampada del microscopio impostata a circa 2,5 volt e il tempo di esposizione a 240 millisecondi. Mettere a fuoco mediante microscopia in campo chiaro per visualizzare le cellule sul monitor del computer. Quindi aggiungere alle cellule una concentrazione di 80 millimolare di ioni potassio o di un altro inductor di apoptosi, sostituendo il mezzo mediante perfusione lenta e localizzata tramite una pompa peristaltica.

Il substrato nuke view 4 88 è stabile nella coltura cellulare per esperimenti della durata massima di 36 ore. Pertanto, è possibile eseguire esperimenti per questo intervallo di tempo. Prima di tutto, configurare il microscopio per visualizzare la fluorescenza delle proteine fluorescenti rossa e verde.

Quindi fare clic sul canale rosso per visualizzare le cellule trasfettate. Selezionare e salvare circa 12 fotogrammi in cui sono presenti diverse cellule trasfettate e salvare questi punti della fase XY. Impostare il microscopio affinché acquisisca immagini nel canale rosso in campo chiaro e nel canale verde in corrispondenza di questi punti della fase salvati ogni sei minuti.

Dopo aver raccolto più punti XY da esperimenti duplicati o triplicati, compilare i dati provenienti da esperimenti separati effettuati in giorni diversi ed eseguire l'analisi dei dati e i test statistici come descritto nel protocollo scritto, al fine di confrontare il rapporto tra cellule negative per CASP bay e cellule positive per CASP bay. Il substrato Nuke view 4 88 può indicare un aumento del tasso di apoptosi nelle colture cellulari gliali oligo DDR N 19. Successivamente a un trattamento con una concentrazione elevata di potassio extracellulare, queste immagini di base sono state acquisite utilizzando un obiettivo 10 volte.

Le cellule N 19 sono state trasfettate con RFP e sono state trattate con tre microlitri di nuke view, substrato 4 88 per le cellule di controllo, oppure con tre microlitri di nuke view, substrato 4 88 e 80 millimolare di potassio. Queste immagini mostrano che il numero di cellule apoptotiche aumenta nel tempo, a tre, sei e nove ore dopo il trattamento con 80 millimolare di potassio; in condizioni di controllo, non sono stati osservati quantitativi significativi di apoptosi rispetto alle colture trattate con 80 millimolare di potassio. Il segnale verde di fondo osservato nelle condizioni di controllo indica le cellule che stanno subendo apoptosi senza l'aggiunta di potassio extracellulare.

Un corso temporale di 12 ore è adeguato per studi che coinvolgono lesioni neurologiche. Dopo 12 ore, le colture trattate con potassio hanno mostrato circa il 45% di morte cellulare. Praticamente nessuna delle cellule nell'esperimento di controllo mostra apoptosi al tempo di 12 ore. Tuttavia, in altre situazioni, potrebbe essere necessario proseguire gli esperimenti per un periodo più lungo.

Questo grafico mostra l'aumento delle cellule positive per la caspasi 3 nel corso dell'esperimento della durata di 12 ore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora e i dati possono essere raccolti durante la notte se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la coerenza tra i diversi trattamenti seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la colorazione immunoistochimica, possono essere utilizzati per osservare altre proteine a valle coinvolte nei percorsi studiati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni per l'analisi mediante imaging, acquisire un set di dati e analizzare i tuoi risultati.