Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre gli studenti universitari delle discipline scientifiche alla tecnologia dei microarray analizzando le differenze di espressione nei lieviti sottoposti a stress ossidativo. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto l'RNA totale da colture di lievito trattate con perossido di idrogeno e dai controlli non trattati. Il secondo passaggio della procedura consiste nella generazione e nella purificazione di CDNA da questi campioni di RNA.

Il cDNA viene quindi utilizzato per preparare CRNA marcati con biotina mediante trascrizione in vitro. L'ultimo passaggio della procedura consiste nella frammentazione dei CRNA marcati con biotina per l'ibridazione con le microarray di lievito AFI. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano le differenze di espressione nei due campioni di lievito e, attraverso l'analisi bioinformatica, dimostrare agli studenti universitari il potere dell'analisi con microarray.

Il team di divulgazione del Vermont Genetics Network ha avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando gli fu affidato il compito di fornire la tecnologia microray agli studenti di scienze in tutto lo stato del Vermont, al fine di potenziare la loro formazione scientifica. Ad oggi, questo metodo è stato fornito a più sedi di otto college baccalaureati in tutto lo stato. Il principale vantaggio dell'utilizzo dei microray nei moduli didattici consiste nella possibilità di insegnare a un gruppo di persone tecniche generali di biologia molecolare comunemente impiegate ogni giorno nei laboratori.

E abbiamo anche modo di utilizzare questo approccio per insegnare a studenti, insegnanti e ai nostri gruppi. Abbiamo effettivamente studenti e professori che lavorano insieme allo stesso progetto. Imparano determinate tecniche che richiedono grande abilità, come la manipolazione dell'RNA, che non è un compito semplice.

Imparano come precipitare il DNA utilizzando reagenti di visualizzazione. Hanno effettivamente modo di utilizzare le tecniche che incontreranno nei corsi di dottorato o nei laboratori di biologia molecolare di routine. Sebbene questo metodo sia adatto per ottenere informazioni sullo stress ossidativo e sui lieviti, è certamente applicabile anche ad altri organismi modello e ad altri sistemi biologici che si desidera studiare.

Le variazioni nell'espressione genica, che siano associate a cambiamenti nello sviluppo, a tossine ambientali, a specifici stati patologici o a molteplici altri fattori, sono numerose. Per esaminare le differenze di espressione nei lieviti sottoposti a stress ossidativo, l'RNA totale viene innanzitutto estratto da due colture di lievito mediante lisi enzimatica. Una coltura è stata esposta a stress ossidativo tramite un trattamento di un'ora con perossido di idrogeno 0,5 millimolare in soluzione salina tamponata di Hank, mentre l'altra coltura è stata trattata solo con HBSS come controllo.

Etichettare innanzitutto due provette microcentrifuga da 1,7 millilitri con le informazioni di identificazione appropriate. Trasferire 1,5 millilitri della coltura di lievito appropriata in ciascuna provetta. Centrifugare le provette a 5.000 G per due minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta microlitrica per rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet. Verificare che il pellet sia sufficientemente grande prima di proseguire con la procedura. Se il pellet è troppo piccolo, aggiungere 1,5 millilitri di coltura nel medesimo tubo contenente il pellet e quindi centrifugare per ottenere un pellet più grande.

Eliminare il soprannatante con una pipetta microlitrica, rimuovendo la maggior quantità possibile di liquido dal pellet di lievito. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone SG e 30 microlitri di soluzione liasi al pellet di lievito e vortexare per mescolare. Incubare entrambe le provette per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'incubazione.

Ruotare delicatamente ogni provetta ogni 10 minuti per generare piastre. Uno dei passaggi più critici durante la piastrellatura sferica di lieviti è assicurarsi di aver effettivamente creato il cento per cento di plastica sferica dopo il trattamento. Ciò significa che non tutti gli enzimi litici sono uguali.

Pertanto, è necessario verificare che un buon enzima litico produca un'adeguata sferoplastazione, il che significa che occorre prelevare questi campioni, posizionarli su un vetrino da microscopio e osservarli al microscopio aggiungendo SDS allo 0,1% per assicurarsi che si formino protoplasti. Per osservare una completa sferoplastazione, pipettare 10 microlitri del campione di lievito su un vetrino da microscopio mentre si esamina il campione al microscopio aggiungendo un microlitro di SDS allo 0,1%, in modo da indurre le cellule di lievito a gonfiarsi e formare sfere o sferoidi perfetti. È importante osservare che anche le cellule in gemmazione formano sferoidi di tipo S.

Se si osserva una piastratura sferica parziale, si raccomanda un trattamento prolungato con liasi. Una volta confermata la piastratura sferica completa, aggiungere 350 microlitri di tampone BRLT a ogni tubo, quindi aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%. Assicurarsi che il tubo sia ben chiuso tenendo il coperchio premuto e vortexare vigorosamente per un minuto.

Questa procedura licherà le piastre Sphero. Successivamente, utilizzare colonne R e easy Z spin per raccogliere e purificare l'RNA dalle due colture. Infine, valutare la qualità dell'RNA estratto mediante elettroforesi su gel di agarosio preconfezionato all'1,2% per preparare CRNA marcato con biotina.

L'RNA totale estratto dalle cellule di lievito viene inizialmente utilizzato per sintetizzare il CD NA mediante trascrizione inversa. Dopo la generazione del CD NA, preparare le provette con gel di blocco di fase per l'uso nella precipitazione del CD NA: centrifugare le provette con gel di blocco di fase a velocità massima per un minuto per assicurarsi che il gel si trovi sul fondo della provetta. Non vortexare le provette con gel di blocco per precipitare il CD NA; pipettare 162 microlitri dello strato inferiore di una miscela di fenolo cloroformiato in tampone tris a pH 8,0, alcol isoamilico, o miscela PCI e aggiungerli al contenuto di 162 microlitri della provetta della reazione di sintesi del secondo filamento di CD NA. Per questo passaggio sono richiesti volumi uguali di miscele acquose e organiche.

Vortexare per cinque secondi per mescolare il contenuto. Successivamente, utilizzare una micropipetta per trasferire tutta la miscela CD N-A-P-C-I nel tubo con gel phase lock. Non vortexare il tubo con gel phase lock; centrifugare a velocità massima per due minuti.

Quindi utilizzare una micropipetta per trasferire lo strato superiore dal tubo con gel di blocco della fase a un nuovo tubo da 1,7 millilitro appena etichettato. Provare a raccogliere la maggior quantità possibile di questo strato. Aggiungere al tubo microcentrifuga da 1,7 millilitro: 405 microlitri di etanolo al 100%, 80 microlitri di acetato di ammonio e un microlitro di pellet paint vortex.

Posizionare brevemente il tubo nella centrifuga con la cerniera del tubo rivolta verso l'esterno e centrifugare alla massima velocità per 20 minuti. A temperatura ambiente, al termine della centrifugazione, rimuovere delicatamente il tubo dalla centrifuga avendo cura di non disturbare il pellet di CD NA. Il pellet dovrebbe essere rosa a causa del colorante e di dimensioni approssimativamente pari a un granello di sale.

E sul lato del tubo sotto la cerniera, mettere il pellet di CD NA sul ghiaccio e procedere immediatamente alla pulizia del pellet. Per iniziare la procedura di pulizia del pellet di CD NA, utilizzare una micropipetta P 1000 per rimuovere con attenzione tutto il soprannatante dal tubo. Avere cura di non disturbare il pellet.

Aggiungere al tubo il campione pari a 500 microlitri di etanolo freddo all'80%. Chiudere delicatamente il tubo e capovolgerlo lentamente diverse volte. Osservare attentamente il pellet per assicurarsi che non si stacchi dalla parete del tubo.

Se il pellet si stacca, è possibile farlo tornare sul fondo del tubo rimettendo il tubo nel rack e lasciando sedimentare il pellet sul fondo oppure centrifugando il tubo alla massima velocità per 15 secondi. Successivamente, utilizzare una micropipetta P1000 per rimuovere con attenzione l'etanolo senza disturbare il pellet. Inclinare il tubo per consentire la rimozione della maggior quantità possibile di liquido.

Aggiungere un nuovo Eloqua di etanolo freddo all'80%, chiudere il tubo e capovolgerlo lentamente diverse volte. Dopo aver rimosso tutto l'etanolo possibile utilizzando una micropipetta P 1000, centrifugare il tubo alla massima velocità per cinque secondi.

Quindi utilizzare una pipetta microlitrica P 10 per rimuovere gli ultimi microlitri di etanolo senza disturbare il pellet. Collocare il tubo aperto in una scatola di essiccazione per 10-20 minuti al fine di far evaporare l'etanolo residuo. Una volta asciutto, il pellet può essere facilmente perso, quindi è necessario manipolare il tubo con delicatezza e richiudere il cappuccio con attenzione.

Al termine dell'essiccazione, visualizzare il pellet essiccato per confermarne la presenza nel tubo. Infine, risospendere il pellet essiccato in 22 microlitri di acqua priva di RNA e posizionare il tubo sul ghiaccio. Questo cDNA viene quindi utilizzato per preparare CRNA marcato con biotina mediante trascrizione in vitro usando il kit Enzo BioArray.

Dopo che l'CRNA marcato con biotina è stato purificato e quantificato, viene frammentato per la preparazione del target. Una volta generato il cDNA, utilizziamo una metodologia standard di trascrizione in vitro per produrre CRNA biotinilato. L'CRNA deve essere sottoposto a frammentazione prima di poter essere applicato al chip per microrray.

Per iniziare questa procedura, trasferire una quantità equivalente a cinque microgrammi di CRNA in una provetta PCR da 0,5 millilitri etichettata. Aggiungere acqua libera da RNA sufficiente per portare il volume totale a 16 microlitri, quindi aggiungere quattro microlitri di buffer di frammentazione 5x alla provetta. Il volume totale nella provetta deve essere di 20 microlitri.

Vortexare il tubo e centrifugare per 10 secondi. Successivamente, incubare il tubo a 94 gradi Celsius per 30 minuti. In un termociclatore, mettere il tubo sul ghiaccio al termine dell'incubazione.

L'RNAc frammentato e non frammentato di ogni campione viene quindi valutato mediante elettroforesi utilizzando un gel AROS preformato all'1,2%. Al termine della corsa, il gel viene visualizzato su un trasilluminatore e viene acquisita un'immagine. Il prodotto finale della sintesi viene ibridato con le microarray del gene di lievito atric e qui vengono mostrati risultati rappresentativi dell'analisi mediante microarray.

Questa prima figura è un esempio di un'immagine scannerizzata di un microarray genico di lievito atrics, generata dal software di funzionamento del microarray atrics. Si tratta di un diagramma a dispersione bidimensionale di tutti i trascritti genetici, circa 6.700 geni, che confronta i dati del lievito di controllo e trattato. Ogni punto rappresenta un singolo gene.

I geni colorati in viola indicano geni che sono espressi in modo differenziale, mentre i geni colorati in rosso non lo sono. In questo esempio, la maggior parte dei geni espressi in modo differenziale sono quelli coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, come indicato dalle loro descrizioni. Questo diagramma a blocchi proveniente dal database per l'annotazione, la visualizzazione e la scoperta integrata illustra i geni espressi in modo differenziale in un percorso biologico interessato.

I geni indicati con una stella rossa indicano i geni downregolati nel percorso mitotico. Infine, vengono mostrati qui i risultati rappresentativi di un grafico a vulcano generato utilizzando il software Geo Species Gene Sifter. I campioni di controllo e quelli trattati sono stati confrontati con un valore P limite di 0,05 e una soglia di variazione dell'espressione pari a 1,5 volte.

Abbiamo scelto di utilizzare lieviti perché sono facili da coltivare rapidamente, ma abbiamo anche compreso che la parte più critica del lavoro con i lieviti consiste effettivamente nel creare una buona sferoplastazione. Una delle cose che non vogliamo fare nell'analisi con microarray è effettuare una digestione incompleta e sferoplastare solo cellule che si trovano in fase G1 o in fase G2/M. In tal caso, si eseguirebbe un esperimento con microarray su lieviti che si trovano in una specifica fase di replicazione.

Un altro aspetto complesso che cerchiamo di evidenziare in questo esercizio è che la formazione del pellet di CD NA, di cui si parla quotidianamente, non è sempre semplice. Nel nostro modulo abbiamo utilizzato specifici tubi e reagenti per la visualizzazione, che permettono effettivamente di centrifugare il DNA e di visualizzare il pellet, rendendo così l'operazione più agevole sia per gli studenti che per gli insegnanti.

Pertanto, può essere utilizzato in tutte le fasi del lavoro su DNA e RNA dopo il suo sviluppo. Questo modulo ha effettivamente aperto la strada ai docenti degli istituti con laurea triennale per esplorare, possibilmente, altri organismi modello o altri regimi di trattamento che potrebbero essere compatibili con i programmi esistenti o con i loro specifici interessi di ricerca. Per fornirvi un esempio di alcune delle modifiche apportate, un sito ha esaminato gli effetti del trattamento con erbicidi sul lievito, un altro ha analizzato il trattamento con LAMP IDE nel lievito, mentre un ulteriore sito ha studiato i cambiamenti nello sviluppo di una linea cellulare di mammifero di particolare interesse.

E infine, un altro studio aveva esaminato l'impatto di diverse fonti luminose su Arabidopsis o su altre piante. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare un esperimento di microraggio con studenti universitari, inclusa l'isolazione di RNA totale da lievito, la generazione di cDNA e la frammentazione di cRNA marcato con biotina. Esperienze pratiche con tecnologie di questo livello contribuiscono a rafforzare e consolidare l'insegnamento delle scienze nei corsi universitari.