Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i profili di espressione genica alla base di numerose fenotipi o vie metaboliche. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto l'mRNA da due ceppi di nematodi contrastanti. Il secondo passaggio della procedura consiste nella sintesi di CD NA contenente sequenze di cattura S SI tre o SFI e nell'ibridazione a un microarray.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'ibridare il microarray con sequenze anti-cattura contenenti S SI tre e SCIFI fluoro quattro. L'ultimo passaggio della procedura è scansionare il microarray e analizzare i dati utilizzando strumenti bioinformatici come il software magic tool. In definitiva, i geni candidati che mediano il fenomeno biologico sotto indagine vengono identificati e possono essere convalidati e quantificati mediante tecniche alternative come la PCR in tempo reale.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché i nucleotidi marcati non sono visibili all'utente, rendendo difficile sovrapporre in modo omogeneo la miscela di ibridazione ai più di 23.000 nucleotidi stampati in modo univoco. Iniziare raccogliendo l'RNA da nematodi sani e sincronizzati. Prima, vengono lavati e risospesi in provette da 15 millilitri e i pellet di vermi ottenuti vengono risospesi in sette millilitri di cloruro di sodio 0,1 molare e sette millilitri di saccarosio al 60% peso/volume, freddo di ghiaccio.

Dopo un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio, i vermi vengono centrifugati nuovamente. A questo punto, i vermi privi di batteri risalgono in sospensione, vengono raccolti, lavati in acqua priva di RNAsi e centrifugati. Ancora una volta, il pellet pulito e leggermente compatto viene trasferito in una provetta da microcentrifuga e centrifugato alla velocità massima per 30 secondi.

Aspirare e conservare in 10 volumi di RNA later a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Per preparare i campioni di RNA totale, centrifugare i pellet preparati alla velocità massima, eliminare il soprannatante e aggiungere una piccola quantità di resina per macinazione molecolare al pellet. Successivamente, congelare la miscela utilizzando azoto liquido e un pestello.

Macinare la sospensione di vermi congelati in una polvere fine, aggiungendo azoto liquido secondo necessità per mantenere fredda la polvere dopo la macinazione. Mettere l'estratto sul ghiaccio per cinque minuti. Dopo cinque minuti, mescolare l'estratto con 700 microlitri di R-L-T-B-M-E e 472 microlitri di etanolo al 100% in totale.

L'RNA può ora essere isolato utilizzando un kit disponibile in commercio fino a un volume finale di 60 microlitri di RNA isolato per campione biologico. Prima di procedere, rimuovere la possibile contaminazione da DNA genomico trattando con DNAS one, seguito dall'uso di un kit di purificazione dell'RNA disponibile in commercio. Completare il kit facendo riferimento a un volume di 60 microlitri.

Infine, determinare la concentrazione di RNA e valutare l'integrità dell'RNA mediante trattamento con carico del campione di glicole, colorante e analisi su gel prima dell'ibridazione con microarray. L'RNA purificato con metodi convenzionali viene trascritto a ritroso in DNA complementare, che viene purificato dallo stampo degradato utilizzando un kit disponibile in commercio e portato a un volume di 60 microlitri. Iniziare l'ibridazione con microarray bloccando l'eleganza del mare. Vetrini per microarray con DNA di sperma di salmone sonificato. Dopo un'ora, immergere i vetrini bloccati in acqua doppio distillata e centrifugare.

Asciugare i vetrini in provette coniche da 50 millilitri foderate con un fazzoletto di carta kim. Preparare ora un buffer di ibridazione a base di formammide 2x. Riscaldarlo prima a 55 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente i cristalli.

Quindi centrifugare per un minuto a 10.000 ×g. Successivamente, mescolare 25 microlitri di CD NA con 25 microlitri di buffer di ibridazione e agitare delicatamente la miscela. Eseguire ora una breve centrifugazione della miscela e incubarla a 80 gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo l'incubazione, pipettare con attenzione l'intero campione di cDNA sul vetrino per microarray senza toccare il vetrino. Per distribuire uniformemente il campione sul vetrino per microarray, abbassare delicatamente un coprioggetto sul vetrino utilizzando un ago di siringa; prima che il coprioggetto sia completamente abbassato, sollevarlo nuovamente e abbassarlo ancora con l'ago, permettendo al coprioggetto di posizionarsi delicatamente.

Questa tecnica minimizza la formazione di bolle d'aria. Posizionare ora il vetrino in posizione orizzontale in un tubo conico da 50 millilitri, posizionando al di sotto del vetrino 50 microlitri di acqua doppio distillata, e lasciare incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, viene eseguita brevemente una seconda ibridazione dopo aver lavato il vetrino.

Più volte nel SSC, il secondo buffer, che contiene reagenti di cattura sensibili alla luce e un reagente Antifa, viene applicato utilizzando la stessa tecnica, seguito da una breve incubazione, ulteriori lavaggi e asciugatura. Il vetrino può quindi essere scansionato. Le immagini possono essere analizzate utilizzando il software gratuito con lo strumento open source magic.

Brevemente, sotto la scheda progetto, creare e salvare un nuovo progetto nella scheda crea profilo di espressione, selezionare carica coppia di immagini e scegliere il file immagine rosso come rosso e il file immagine verde come verde. Quindi selezionare la scheda crea profilo di espressione. Scegliere carica lista geni per caricare un file di lista genica di C. elegans ottenuto dal sito web GCAT al fine di allineare e grigliare l'immagine del microarray.

Selezionare la scheda profilo di espressione del chip e l'opzione crea modifica griglia. Modificare ora la griglia. Impostare la finestra di dialogo inserendo 48 come numero di griglie, 22 righe e 22 colonne per ciascuna griglia e scegliendo di numerare i punti da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.

Aumentare la percentuale di modifica del contrasto e ingrandire la griglia fino a quando i singoli punti sono facilmente distinguibili. Creare le griglie selezionando il punto in alto a sinistra nel pannello sinistro e quindi facendo clic sul centro del punto in alto a sinistra, seguito dal punto in alto a destra e dalla riga inferiore sulla griglia uno. Ripetere questa procedura di grigliatura per ciascuna delle 48 griglie procedendo da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.

Quindi salvare selezionando la scheda file e salvando la griglia corrente. Selezionare la scheda completata per eliminare eventuali spot non pertinenti dall'analisi. Aprire la scheda crea profilo di espressione e, nell'opzione di grigliatura per indirizzamento, selezionare la marcatura degli spot.

Ora contrassegna eventuali tracce o fluorescenza di fondo e salva selezionando "salva contrassegni attuali". Come nella scheda file, i file contrassegnati devono essere segmentati. Infine, analizza i geni indotti o repressi da un fattore specifico selezionando "esplora" nella scheda espressione.

Nella finestra di dialogo di esplorazione, impostare i criteri di corrispondenza per i geni specifici. Il numero di aumenti o diminuzioni del doppio nell'espressione. L'intensità è indicata con x e il valore di X rappresenta il criterio per il cambiamento di espressione.

X viene inserito con un valore massimo maggiore di X per i geni indotti e un valore minimo minore di x per i geni repressi. In questo esperimento, viene eseguito un controllo con scambio di colorante: due isolamenti indipendenti di RNA totale da larve allo stadio tre e allo stadio quattro vengono ibridati come mutante verde versus selvatico rosso e come mutante rosso versus selvatico verde, per confermare le variazioni nell'espressione genica. Effettuare tre isolamenti indipendenti di RNA totale utilizzando la stessa procedura, sintetizzare il cDNA con un kit commercialmente disponibile e, per ogni campione di cDNA, eseguire una PCR in tempo reale in triplicato utilizzando tre geni di controllo costitutivi. A scopo dimostrativo, i seguenti risultati esaminano l'espressione genica indotta in VSM uno.

I mutanti AK 1468 sono una ceppa di nematodi caratterizzata da un potenziamento sinaptico; prima di eseguire l'analisi con microarray, la qualità dell'RNA estratto viene verificata mediante elettroforesi su gel. La presenza di due subunità ribosomiali integre prima e dopo il trattamento con una nucleasi è indicativa di un buon campione di RNA nell'analisi con microarray. Il cDNA del ceppo selvatico è marcato in rosso e il cDNA del mutante VSM uno è marcato in verde. In questo esempio, uno dei 48 griglie analizzati per ogni microarray, ogni piccolo quadrato rappresenta un singolo oligonucleotide stampato; in ogni array, ogni oligonucleotide unico è rappresentato.

Una volta che l'analisi con microarray dei trascritti isolati da larve allo stadio quattro mostra che i geni che codificano per le proteine spermatiche maggiori, o MSP, sono indotti nei mutanti VSM uno, l'analisi con microarray di larve allo stadio tre rivela anche cambiamenti nell'espressione all'interno della stessa famiglia genica nel mutante. Il test delle previsioni ottenute con il microarray mediante analisi PCR in tempo reale rivela che un membro della famiglia genica M s P, M s P 32, è indotto nei mutanti VSM uno. I dati rappresentano la media di tre replicati di PCR in tempo reale effettuati a partire dalla stessa raccolta di RNA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare strumenti bioinformatici per l'analisi su scala genomica, soprattutto considerando che molti programmi bioinformatici open source sono disponibili per la comunità scientifica.