Passaging cellule staminali neuronali

Ciao, sono Steve. Lavoro nel laboratorio del dottor Flanagan presso il Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Università della California, Irvine. Oggi vi mostrerò come suddividere le cellule precursori neurali umane.

Questa tecnica prevede la codifica di un nuovo flacone con una soluzione di fibronectina umana, il distacco delle cellule mediante buffer di dissociazione cellulare, la successiva neutralizzazione del buffer di dissociazione cellulare con una soluzione al 10% di siero, la centrifugazione della sospensione cellulare e la risospensione delle cellule in mezzo fresco, trasferendo infine la sospensione cellulare in un nuovo flacone. Nel nostro laboratorio coltiviamo cellule precursori neurali umane sostituendo metà del mezzo ogni due giorni e passaggiamo le cellule circa una volta alla settimana con un rapporto di suddivisione da uno a due. Quando passaggio le cellule, potrei contarle se desidero utilizzarle per un esperimento di immunoistochimica o se intendo effettuare una trasfezione con un effettore nucleare.

È importante utilizzare un buffer di dissociazione cellulare durante il confezionamento delle cellule perché, innanzitutto, è non enzimatico, a differenza della tripsina, ed è molto più delicato sulle cellule. Ciao, siamo nella stanza di coltura tessutale ora, e prima di mostrarvi come appare un flacone confluito di cellule precursori umane, preparerò innanzitutto la coltura tessutale. Per prima cosa, spegnerò la luce UV e accenderò la luce e il flusso d'aria.

Successivamente, disinfetterò la cappa con etanolo al 70% spruzzando un tovagliolo di carta e pulendo l'interno della cappa. È importante spruzzare il tovagliolo di carta con etanolo al 70% invece di spruzzare direttamente l'interno della cappa, perché l'irrorazione della cappa con etanolo al 70% potrebbe danneggiare il filtro HEPA, il quale è molto costoso. Successivamente, spruzzerò tutti i reagenti e gli strumenti.

E infine, andrò a spruzzare le tubazioni del vuoto, e saremo pronti. Diamo un'occhiata a queste cellule. Queste cellule appaiono circa all'80% confluenti.

Queste sono cellule precursori neurali umane isolate da feti umani, e le coltiviamo in fiaschi T 25. Le suddividiamo circa ogni settimana, da uno a due. Ora sono pronto per il passaggio delle mie cellule.

E ora prenderò un nuovo fiasco T 25 che ho rivestito per quattro ore con fibronectina umana da BD biosciences. Quindi ho rimosso la soluzione di fibronectina. Sciacquierò questo fiasco con BBS prima di trasferire le cellule nel fiasco.

Ora andrò a prelevare le cellule dall'incubatore a 37 gradi. Eccole qui. Ora rimuoverò la soluzione di lavaggio PBS dal nuovo fiasco rivestito con fibronectina umana.

E aggiungerò due millilitri di vecchio mezzo condizionato nel nuovo fiasco. Ora devo lavare le mie cellule con PBS prima di staccarle dalla superficie. Per prima cosa, rimuoverò il mezzo residuo, aggiungendo subito circa due millilitri di PBS senza lasciare asciugare le cellule.

Attenderò circa due minuti prima di rimuovere il PBS e aggiungere il buffer di dissociazione cellulare, in modo da staccare le cellule dalla superficie della provetta. Ora rimuoverò il PBS e, ancora una volta, cercherò di aggiungere immediatamente il buffer di dissociazione cellulare per evitare che le cellule si secchino. Aggiungerò quindi 1,5 mL di buffer di dissociazione cellulare.

E a differenza del PBS, lo aggiungerò direttamente sulle cellule cercando di coprire la maggior superficie possibile. Mentre aggiungo lentamente questo tampone sulle cellule, muovo la fiasca da un lato all'altro. Ora aspetterò circa cinque minuti affinché le cellule inizino a staccarsi dalla superficie.

E lascerò il matraccio a temperatura ambiente nella cappa. Come potete vedere qui, le cellule iniziano prima ad arrotondarsi e poi a staccarsi dalla superficie e in effetti si possono già notare alcune cellule in sospensione. E se si batte leggermente sul lato del matraccio, ciò le aiuterà a staccarsi.

Quindi sono passati cinque minuti, e come si può vedere, la soluzione si è notevolmente concentrata di cellule staccatesi dalla superficie. Ora neutralizzerò l'effetto del buffer di dissociazione cellulare aggiungendo 4,5 ml di mezzo contenente siero. Userò siero bovino fetale inattivato termicamente al 10% in mezzo D-M-E-M-F 12, e lo aggiungerò direttamente sulla superficie della fiasca per assicurarmi che non rimangano cellule attaccate.

E ora eseguirò un'accurata pipettatura su e giù per staccare eventuali cellule residue. Successivamente, trasferirò la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 ml e la centrifugerò a mille giri al minuto per un minuto.

Quindi le cellule hanno terminato la centrifugazione ed ecco un bel pellet cellulare. Rimuoverò il mezzo con siero in modo molto, molto accurato, senza cercare di disturbare il pellet. Successivamente, risospendo il pellet in quattro millilitri di mezzo.

Quindi cercherò di risospendere il pellet in modo che non rimangano grumi cellulari e la soluzione diventi omogenea e priva di aggregati. E poiché sto effettuando un suddivisione uno a due, prenderò due dei quattro millilitri e li trasferirò nel nuovo fiasco che contiene già due millilitri di mezzo condizionato. Infine, etichetterò il fiasco con il tipo cellulare, il numero di passaggio e la data.

Questo è un esame delle cellule che abbiamo passato mezz'ora fa. Come potete vedere, la maggior parte di esse si è già attaccata alla superficie e ha iniziato a emettere prolungamenti. È tutto, ragazzi.

E ora sono pronto per contare.