iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere una mappa a livello trascrittomico dei siti di legame di una proteina legante l'RNA con risoluzione a singolo nucleotide. Questo risultato si ottiene mediante irradiazione con raggi UV di cellule vive per cross-linkare covalentemente proteine e RNA in vivo come secondo passaggio. La proteina legante l'RNA viene purificata mediante immunoprecipitazione in condizioni stringenti al fine di recuperare i frammenti di RNA cross-linkati.

Successivamente, la trascrizione inversa genera cDNA che spesso si troncano a livello del peptide legato, preservando così l'informazione sulla posizione del cross-link all'interno dell'RNA. I risultati ottenuti mostrano tutti i siti di legame all'interno del trascrittoma, basandosi sul sequenziamento ad alto rendimento della libreria di cDNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dell'RNA, come ad esempio come l'interazione tra diverse proteine leganti l'RNA regoli l'elaborazione dell'RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che aumentiamo sia le prestazioni sia la risoluzione delle nostre mappe su scala trascrittoma delle interazioni proteina-RNA. Per iniziare la procedura di cross-linking mediante UV su cellule in coltura.

Rimuovere il mezzo da una piastra di cellule healer da 10 centimetri. Aggiungere sei millilitri di PBS ghiacciato e posizionare le piastre sul ghiaccio. Una piastra è sufficiente per tre esperimenti.

Rimuovere il coperchio e irradiare le cellule. Una volta a 254 nanometri con 150 millijoule per centimetro quadrato, raccogliere le cellule staccandole dalle piastre con un cell lifter e trasferire due millilitri di sospensione cellulare in ciascuna di tre microprovette per ottenere il pellet cellulare. Centrifugare a velocità massima per 10 secondi a quattro gradi Celsius.

Quindi rimuovere il tappo a vite, congelare i pellet cellulari su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Aggiungere 100 microlitri di proteina, un dyna bead per esperimento, in una nuova provetta microcentrifuga. Se si lavora con anticorpi di topo o di capra, utilizzare dyna beads con proteina G.

Lavare le perle due volte con il buffer di lisi, disponibile nel protocollo scritto allegato. Risospendere le perle in 100 microlitri di buffer di lisi con due-cinque microgrammi di anticorpo. Ruotare il tubo a temperatura ambiente per 30-60 minuti.

Quindi lavare le perle tre volte con 900 microlitri di buffer di lisi e lasciarle nell'ultimo lavaggio fino al momento dell'utilizzo. Per l'immunoprecipitazione, mantenere la cellula Thor palazzo sul ghiaccio. Risospendere in un millilitro di buffer di lisi e trasferire in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Preparare un'analisi da uno a 500 di RNAs uno. Quindi aggiungere 10 microlitri insieme a due microlitri di turbo DNAs al lisato cellulare. Incubare i campioni esattamente per tre minuti a 37 gradi Celsius, agitando a 1.100 rotazioni al minuto, quindi trasferire immediatamente sul ghiaccio.

Quindi centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius e 22.000 ×g per 20 minuti per chiarificare il lisato; raccogliere con attenzione il sopernatante, lasciando circa 50 microlitri di lisato con il pellet. Rimuovere il buffer di lavaggio, quindi aggiungere i lisati cellulari preparati. Incubare i campioni in rotazione per due ore a quattro gradi Celsius.

Scartare l'agente SUP e lavare le perle due volte con 900 microlitri di tampone ad alto contenuto salino, disponibile nel protocollo scritto allegato. Infine, lavare le perle due volte con 900 microlitri di tampone di lavaggio. Procedere quindi alla de fosforilazione e aggiungere un linker alle estremità tre primi dell'RNA.

Per etichettare le estremità 5' dell'RNA lavorando dietro uno schermo in plexiglass. Rimuovere il soprannatante dall'ultimo lavaggio della reazione di ligazione del linker e risospendere le perle in otto microlitri di mix caldo di PNK. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Rimuovere la miscela calda di PNK e riutilizzarla. Sospendere le perle in 20 microlitri di tampone di caricamento new page una volta. Successivamente, incubare il campione in un termomixer a 70 gradi Celsius per 10 minuti.

Posizionare immediatamente il campione su un magnete per precipitare le perle vuote. Caricare i campioni su un gel Biss di nuova pagina da 4 a 12% seguendo le istruzioni del produttore.

Inoltre, caricare cinque microlitri di un marcatore proteico precolorato di dimensioni note. Eseguire l'elettroforesi per 50 minuti a 180 volt. Trasferire i complessi proteina-RNA dal gel su una membrana di nitrocellulosa utilizzando l'apparato di trasferimento umido NOVA seguendo le istruzioni del produttore.

Dopo il trasferimento, lavare la membrana in tampone PBS. Quindi avvolgerla nella pellicola trasparente e esporla su pellicola a meno 80 gradi Celsius. Effettuare esposizioni di 30 minuti, un'ora e tutta la notte.

Successivamente, isolare la regione della membrana contenente i complessi proteina-RNA a partire dagli RNA a basso peso molecolare. Eseguire l'esperimento utilizzando l'autoradiografia come maschera. Recuperare l'RNA dalla membrana mediante digestione con proteinasi K ed estrazione con fenolo-cloroformio.

Trascrivere al contrario l'RNA utilizzando uno dei primer AYP per purificare il CDNA in gel. Mescolare sei microlitri di campione di CDNA con sei microlitri di buffer di caricamento al due volte TBE-urea. Immediatamente prima di caricare i campioni su un gel.

Riscaldare i campioni a 80 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, caricare i campioni su un gel preformato di urea 6%TBE insieme a un marcatore di peso molecolare basso. Far correre il gel per 40 minuti a 180 volt come descritto dal produttore, utilizzando il colorante superiore e i segni sul supporto di plastica del gel per guidare l'escissione.

Tagliare tre bande a 120-200 nucleotidi, 85-120 nucleotidi e 70-85 nucleotidi. Si noti che il primer arc lip e la sequenza L tre insieme costituiscono 52 nucleotidi della sequenza clip. Aggiungere 400 microlitri di te e frantumare il frammento di gel in piccoli pezzi.

Utilizzando lo stantuffo di una siringa da un millilitro, incubare i pezzetti di gel con agitazione a 1.100 giri al minuto per due ore a 37 gradi Celsius. Posizionare due prefiltri in vetro di un centimetro in una colonna CoStar SpinX. Trasferire la frazione liquida del campione nella colonna e centrifugare per un minuto a 13.000 giri al minuto in un tubo da 1,5 millilitri.

Aggiungere 0,5 microlitri di glyco blue e 40 microlitri di acetato di sodio pH 5,5. Quindi mescolare il campione. Aggiungere un millilitro di etanolo al 100%.

Mescolare nuovamente e precipitare il campione per tutta la notte a meno 20 gradi Celsius. Infine, circolarizzare le molecole di CD NA per agganciare la regione adattatrice all'estremità cinque primi. Successivamente, riaprire in forma lineare e amplificare tramite PCR seguendo il protocollo scritto allegato prima del sequenziamento della libreria eye clip; il successo dell'esperimento può essere monitorato in due fasi.

L'autoradiografia del complesso proteina-RNA dopo il trasferimento su membrana e l'immagine del gel dei prodotti di PCR nell'autoradiografia dei campioni con bassa quantità di RNA, si dovrebbe osservare una radioattività diffusa al di sopra del peso molecolare della proteina nei campioni con elevata quantità di RNA. Questa radioattività è concentrata più vicino al peso molecolare della proteina. Quando nell'immunoprecipitazione non viene utilizzato alcun anticorpo, nessun segnale dovrebbe essere rilevato.

Ulteriori controlli importanti per la specificità dell'immunoprecipitazione prevedono l'uso di radiazioni UVE o di cellule che non esprimono la proteina di interesse. L'immagine del gel dei prodotti di PCR dovrebbe mostrare un intervallo di dimensioni corrispondente alla frazione di CD NA. Si noti che i primer di PCR, P tre Celexa e P cinque Celexa, aggiungono ulteriori 76 nucleotidi alla dimensione del CD NA. Se durante l'immunoprecipitazione non viene utilizzato alcun anticorpo, non dovrebbe essere rilevato alcun prodotto di PCR corrispondente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che ciascuno dei 64 passaggi è fondamentale e deve essere eseguito con una precisione del cento per cento. I dati ICL possono essere integrati computazionalmente con saggi funzionali su scala trascrittomica. Ciò può, ad esempio, fornire informazioni sulla regolazione dipendente dalla posizione del processamento dell'RNA.

Per l'analisi computazionale dei dati, desideriamo rimandare alle nostre recenti pubblicazioni realizzate in collaborazione con Nicholas KA dell'Istituto Europeo di Bioinformatica e bla zupan dell'Università di Liana. Ora è il momento di iniziare i vostri esperimenti. Buon divertimento.