Studiare Traiettorie cellulare Rolling Patterns Receptor asimmetrica
13 febbraio 2011
Abbiamo descritto un protocollo per osservare e analizzare le traiettorie delle cellule che rotola su asimmetrici recettore fantasia substrati. I dati risultanti sono utili per l'ingegneria del recettore-fantasia substrati per etichette senza separazione delle cellule e l'analisi.
Questo protocollo osserva e analizza le traiettorie di rotolamento delle cellule su schemi asimmetrici di recettori per facilitare l'ingegnerizzazione di substrati con schemi di recettori per la separazione e l'analisi di cellule senza etichette. Si inizia con la stampa microcontattica di molecole PEG su un substrato d'oro per creare schemi alternati di monolayer autoassemblati, seguita dal riempimento del substrato con P-selectina e recettori. Successivamente, si incorpora il substrato nella camera di flusso. Si fa quindi fluire le cellule HL-60 nella camera.
Registra una sequenza di immagini dell'interazione di rotolamento delle cellule HL 60 su schemi di P-selectina e analizza le immagini convertite dal video. Le traiettorie del bordo cellulare in rotolamento, la lunghezza del tracciamento e le velocità di rotolamento su piano, regione e bordo possono essere ottenute utilizzando un programma MATLAB. Questo metodo può fornire informazioni su come le cellule HO 60 si muovono su schemi asimmetrici di recettori in flusso di taglio.
Questo può essere applicato per quantificare altre interazioni sulla superficie cellulare, per l'analisi diretta delle cellule osservando le loro traiettorie su modelli di recettori e per la progettazione di dispositivi microscopici per la separazione cellulare. La stampa microscopica per contatto viene utilizzata per creare modelli alternati di monocouche autoassemblate di molecole di peg sul substrato d'oro.
Inkia innanzitutto il timbro in PDMS con una soluzione di PEG a cinque millimoli in etanolo. Lasciare asciugare la superficie per 20 minuti. Appoggiare delicatamente il timbro sulla superficie d'oro per 40 secondi, assicurandosi che vi sia un buon contatto tra la superficie d'oro e il timbro.
Non è richiesta alcuna pressione eccessiva. Risciacquare la superficie con etanolo ed essiccare sotto un flusso di azoto. Utilizzando ora una camera di perfusione, incubare i substrati con una soluzione di P-selectina a 15 microgrammi per millilitro per tre ore a temperatura ambiente, al fine di marcare le aree rimanenti con P-selectina; risciacquare quindi la camera e riempire nuovamente le superfici con BSA a un milligrammo per millilitro per un'ora, per bloccare le interazioni non specifiche.
Risciacquare la superficie con tampone DPBS prima di eseguire l'esperimento di rolling cellulare. Assemblare la camera di flusso e quindi far passare una sospensione di 10 alla quinta cellule per millilitro. Cellule HL 60 sulla matrice, superfici in una camera di flusso rettangolare con angoli di inclinazione della matrice recettoriale di 10 gradi.
A temperatura ambiente di 24,5 gradi Celsius. Regolare la pompa a siringa per generare una portata di 75 microlitri al minuto con uno sforzo di taglio laminare corrispondente di 0,5 dine per centimetro quadrato. Ora, utilizzando un microscopio invertito dotato di telecamera montata, registrare il rotolamento delle cellule HL 60.
Interazioni con p adesivo, select e substrati. Utilizzare un obiettivo 4x a una velocità di un fotogramma al secondo per durate di 300 secondi. Eseguire tre esperimenti indipendenti.
Presentare i dati come media e deviazione standard dei valori medi ottenuti da ciascun esperimento. Le immagini al microscopio convertite dal video di HL 60.Rolling. Interazioni con substrati adesivi mostrano regioni chiare e scure corrispondenti rispettivamente al recettore p-selectina e alle regioni di PEG.
I percorsi sono delineati utilizzando un programma MATLAB personalizzato. L'angolo di inclinazione del bordo era di 10 gradi e la tensione di taglio era di 0,5 dine per centimetro quadrato. Ulteriori analisi si basano sulla distribuzione della lunghezza di tracciamento del bordo, sul valore medio della lunghezza di tracciamento del bordo, nonché su VE e VP, le velocità di rotolamento sul bordo e all'interno delle bande.
Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare le traiettorie cellulari sui modelli asimmetrici di recettori.
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Panoramica
Questo protocollo osserva e analizza le traiettorie di rotolamento delle cellule su schemi asimmetrici di recettori, al fine di facilitare l'ingegnerizzazione di substrati con schemi di recettori per la separazione e l'analisi di cellule senza etichette.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Biomateriali
- Microfluidica
Sfondo
- Il rotolamento cellulare è un processo fondamentale in varie interazioni biologiche.
- Modelli asimmetrici di recettori possono influenzare il comportamento cellulare.
- Le tecniche senza etichetta sono essenziali per la separazione e l'analisi delle cellule.
- La stampa per microcontatto è un metodo utile per creare substrati con modelli definiti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per osservare il rotolamento delle cellule su substrati con pattern di recettori.
- Analizzare le traiettorie delle cellule in rotolamento per un migliore ingegnerizzazione dei substrati.
- Fornire informazioni sulle dinamiche del movimento cellulare in condizioni di flusso.
Metodi Utilizzati
- Microstampa per contatto di molecole di PEG su un substrato d'oro.
- Creazione di schemi alternati di monocouche autoassemblate.
- Riempimento retrogrado del substrato con P-selectina e recettori.
- Incorporazione della camera a flusso e imaging di cellule HL-60 che rotolano sugli schemi.
Risultati principali
- Sono state registrate sequenze di immagini delle interazioni delle cellule HL-60.
- Le traiettorie delle cellule in rotolamento sono state analizzate utilizzando MATLAB.
- Sono stati ottenuti dati sulla lunghezza del tracciamento del bordo e sulle velocità di rotolamento.
- Sono state fornite informazioni sul movimento cellulare su schemi asimmetrici di recettori.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'analisi dettagliata della dinamica del rotolamento cellulare.
- Pattern asimmetrici di recettori possono essere progettati per una separazione cellulare efficace.
- Questo metodo contribuisce alla comprensione del comportamento cellulare in flusso di taglio.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere le traiettorie di rotolamento delle cellule su modelli asimmetrici di recettori permette una progettazione razionale di dispositivi di separazione microfluidici senza etichetta. Questo protocollo fornisce dati quantitativi sulla lunghezza del percorso lungo i bordi e sulla velocità di rotolamento sotto una definita tensione di taglio, sostenendo la modellazione predittiva del comportamento cellulare in flusso. Queste informazioni riducono le iterazioni empiriche nell'ingegnerizzazione dei dispositivi per flussi di lavoro di purificazione cellulare e analisi fenotipica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi della cinetica di legame ligando-recettore in condizioni di shear fisiologico, fornendo informazioni per la validazione di bersagli in percorsi mediati dall'adesione.
- Valore operativo: Offre un metodo senza marcatura per valutare l'attività funzionale del recettore senza l'uso di marcatori fluorescenti o reporter genetici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative della velocità di rotolamento cellulare e della lunghezza di tracciamento del bordo per analisi comparative tra diverse densità recettoriali o geometrie di pattern.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei substrati mediante stampa microcontattica e integrazione della camera a flusso per saggi di adesione riproducibili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico delle strategie di separazione basate sull'adesione, collegando la progettazione dei modelli recettoriali ai risultati osservabili delle traiettorie cellulari.
- Valore operativo: Consente lo screening di fenotipi cellulari in base al comportamento di rotolamento, utile per l'arricchimento di sottopopolazioni nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta per guidare lo sviluppo di saggi e la generazione di strumenti preclinici, in particolare per bersagli in cui l'adesione sotto flusso rappresenta un parametro funzionale di lettura.
- Biologia della Scoperta Facilita la verifica di ipotesi sulle interazioni recettore-legante in condizioni di flusso tangenziale, chiarificando i contributi meccanicistici al rotolamento cellulare.
- Screening: Fornisce metriche quantitative standardizzate di adesione, consentendo il confronto tra linee cellulari o modulatori dei recettori.
- Analitica: Fornisce le distribuzioni della lunghezza di tracciamento dei bordi e della velocità di rotolamento, offrendo una base statistica per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale Collega la dinamica del rotolamento in vitro all'utilità potenziale in dispositivi di separazione cellulare senza etichette per l'elaborazione di campioni preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione del comportamento cellulare mediato dall'adesione su multipli bersagli e tipi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei meccanismi di separazione basati sull'adesione quantificando i parametri della traiettoria in condizioni di shear controllato.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso una stampa microcontattica standardizzata, il riempimento retroattivo dei recettori e l'allestimento standardizzato della camera a flusso.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fase avanzata dello sviluppo del dispositivo consentendo una validazione funzionale precoce dei modelli di recettori.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione per le tecnologie di separazione microfluidiche fornendo dati empirici sulle prestazioni dei modelli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella stampa mediante microcontatto, nella chimica delle superfici e nel controllo del flusso microfluidico.
- È subordinato all'accesso a microscopia ottica a campo chiaro invertita, telecamera ad alta velocità e strumenti per il tracciamento delle particelle basati su MATLAB.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella fabbricazione dei substrati e nella segnalazione delle condizioni di flusso, al fine di garantire la riproducibilità in più sedi.
- L'adattamento a tipi cellulari alternativi richiede la validazione delle coppie ligando-recettore e l'ottimizzazione dei parametri di stress di taglio.
- È limitato dalla natura transitoria delle interazioni ai margini cellulari, il che rende difficoltosa la ricostruzione completa delle traiettorie e impone un'analisi segmentata.
