Bimolecolari complementazione fluorescenza

Questo esperimento ha lo scopo di determinare se due proteine interagiscono all'interno delle cellule e di definire aspetti relativi ai siti di tale interazione. Inizialmente, le cellule vengono trasfettate con costrutti di espressione che codificano per le due proteine di interesse, una delle quali è fusa al termine N di una proteina fluorescente frammentata e l'altra al termine C complementare della stessa proteina fluorescente frammentata. Dopo aver consentito alle cellule trasfettate di sviluppare un segnale fluorescente in coltura, i complessi proteici vengono visualizzati mediante imaging e immuno-blotting.

Successivamente, le immagini raccolte vengono esportate in un software di elaborazione delle immagini come Image J al fine di quantificare l'intensità media della fluorescenza per cellula. In un esperimento controllato, i risultati di BIFC possono dimostrare interazioni proteina-proteina e la localizzazione di questi complessi, come ad esempio i domini SH3 della proteina scaffold intersectina e il dominio ricco di prolina di PI3KC2β. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la codistribuzione, l'immunoprecipitazione e il FRET, è che BIFC consente la localizzazione spaziale di interazioni transitorie più deboli all'interno della cellula. Inoltre, questo metodo non richiede un'estesa post-elaborazione delle immagini, come avviene nel caso del FRET.

Questo metodo può affrontare domande fondamentali nel campo della trasduzione del segnale, come ad esempio se le proteine X e Y interagiscono, e in caso affermativo, in quali compartimenti specifici queste complesse si localizzano all'interno della cellula. In generale, i principianti di questo metodo incontreranno difficoltà perché non avranno scelto la configurazione appropriata per esprimere il loro campione bioptico. Per le proteine di interesse marcate, iniziare selezionando uno dei diversi fluorofori disponibili per le proteine fuse BIFC.

Si consideri che le estremità ammino e carbossi terminali di Venus sono in grado di formare un complesso a 37 gradi Celsius, mentre i frammenti Y-F-P-B-I-F-C richiedono un pre-incubazione a 30 gradi Celsius. Progettare vettori di espressione per l'aggiunta di marcatori alle proteine di interesse tenendo conto di come l'aggiunta dei frammenti BIFC possa influenzare la funzione delle proteine di interesse. Ad esempio, la famiglia delle RAs, le GTPasi, è modificata lipidicamente a livello dell'estremità carbossi terminale e non può essere marcata a questo estremo senza interrompere tale modifica.

Eseguire sempre esperimenti pilota per determinare le condizioni di trasfezione. Inoltre, monitorare le cellule mediante microscopia a fluorescenza per identificare il momento ottimale di sviluppo del segnale. Successivamente, eseguire l'analisi western blot per confermare l'espressione equivalente dei costrutti.

È importante eseguire una colorazione immunoistochimica per il marcatore HA o flag per verificare che l'aggiunta dei frammenti BIFC non alteri la localizzazione cellulare delle proteine di interesse per ciascuna piastra campione. Piastrare 1,3 × 10⁵ cellule per ciascuna su una piastra con fondo in vetro e in due pozzetti di una piastra a sei pozzetti e lasciare sedimentare le cellule durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, preparare il DNA per la trasfezione mediante lipofezione o un altro metodo preferito.

Per prima cosa, diluire il DNA in 250 microlitri di DMEM privo di siero come controllo della trasfezione. Aggiungere CFP in un rapporto di 1:50, rispetto alla quantità totale dei DNA BIFC. Ora diluire il lipofetto in 250 microlitri di DMEM privo di siero, utilizzando 10 microlitri di lipofetto per ogni microgrammo di DNA.

Mescolare le diluizioni di DNA e lipidi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare le cellule due volte con DMEM privo di siero e riscaldato. Aggiungere due millilitri di DMEM privo di siero a ogni piastra con fondo in vetro o pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Quindi dividere uniformemente ciascuna miscela di trasfezione tra una piastra con fondo in vetro e due pozzetti di una piastra a sei pozzetti, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque ore. Infine, rimuovere il mezzo di trasfezione e sostituirlo con mezzo DMEM completo aggiunto di 10% di FBS.

Incubare le cellule per il tempo determinato in esperimenti pilota per ottenere i livelli necessari di espressione delle proteine di interesse. Esaminare le cellule trasfettate al microscopio epifluorescente per verificare che il controllo positivo sia fluorescente. Lavare le cellule tre volte con PBS per l'acquisizione di immagini su cellule vive.

Posizionare le cellule in un mezzo privo di coloranti indicatori. Per l'acquisizione di immagini di cellule fissate, aggiungere paraformaldeide al 2% e mettere in ghiaccio per 10 minuti.

Quindi lavare le cellule tre volte con PBS, ora coperte con un millilitro di PBS, e conservare al buio a quattro gradi Celsius, lisiando immediatamente le cellule nella piastra a sei pozzetti. Per le analisi di Western blot, è importante che tutte le cellule siano preparate contemporaneamente in modo che le cellule lisate siano rappresentative delle cellule utilizzate per l'immagine. Eseguire un Western blot per verificare che le proteine marcate siano espresse a livelli equivalenti.

Quando si esegue l'immagine di cellule con un microscopio confocale, è importante mantenere costanti le impostazioni per tutta la durata dell'esperimento in modo che la fluorescenza sia confrontabile tra i campioni. Assicurarsi di acquisire immagini di cellule singole in cui i pixel non siano saturi. Poiché il CFP è stato incluso come controllo di trasfezione, selezionare solo le cellule positive al CFP per l'analisi dei segnali BIFC.

Quantificare la fluorescenza utilizzando un software di analisi delle immagini come ImageJ. Aprire i file delle immagini in ImageJ. Andare su Analizza e impostare le misurazioni. Selezionare le caselle per area e valore medio di grigio nella finestra delle misurazioni. Si noti che in questo esempio, le immagini venose sono state colorate artificialmente di verde e le immagini CFP colorate artificialmente di rosso.

Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, tracciare un contorno lungo il bordo dell'intera cellula nel canale CFP, lasciando questo contorno al suo posto. Passare al canale YFP. Andare su analizza, misurare il valore medio di grigio che riflette l'intensità media della fluorescenza per cellula in ogni immagine.

Disegnare un cerchio nel canale YFP in un'area che non contiene una cellula. Effettuare una misurazione di quest'area come fondo. Sottrarre il fondo da ogni immagine.

Infine, per calcolare l'intensità media della fluorescenza per una popolazione di cellule, calcolare la media del valore medio sottratto il fondo per tutte le cellule immaginate in un campione. Idealmente, quantificare 60 cellule su tre esperimenti. La proteina di ancoraggio multifunzionale intersectina regola la sopravvivenza neuronale attraverso la regolazione di una nuova classe di chinasi PI tre di tipo due, PI tre KC due beta. I domini SH tre di intersectina interagiscono con la regione ricca di prolina all'estremità ammino-terminale di PI tre KC due beta. La trasfezione di intersectina marcata con VN insieme a PI tre KC due beta marcata con VC produce un segnale fluorescente nel canale YFP, colorato artificialmente in verde, che indica la formazione di un complesso.

CFP colorato artificialmente di rosso qui viene utilizzato come controllo per identificare le cellule transfezionate. Mutazioni nel dominio ricco di prolina di PI tre KC due beta, che interrompono la co-precipitazione di intersectina e PI tre KC due beta, riducono il segnale BIFC. Questa differenza nel segnale BIFC non è dovuta a differenze nell'espressione delle proteine di tipo selvaggio e PA PI tre K. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è necessario ricordare di eseguire i controlli appropriati e verificare l'espressione delle proteine, per assicurarsi che le differenze nel segnale BC siano attribuibili a differenze nella formazione del complesso e non all'espressione proteica successiva a questa procedura.

Tecniche alternative, come la risonanza plasmonica di superficie, possono essere eseguite per rispondere a domande quali quali sono le diverse affinità di questi complessi l'uno rispetto all'altro?