Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Per verificare l'interazione tra due proteine, i due geni di interesse devono essere clonati nei vettori BF e utilizzando la tecnica di ricombinazione Gateway. Questi costrutti vengono trasformati in *Agrobacterium tumefaciens* GV3101. Le colture batteriche GV3101 contenenti i costrutti verranno quindi mescolate e con-infiltrate nelle foglie.

Se le due proteine candidato interagiscono tra loro, il segnale YFP può essere osservato utilizzando outcome focale Mexico. Lo scopo principale della tecnica BFC è verificare l'interazione tra due proteine. In vavo, abbiamo creato una serie di vettori BFC e IS two hybrid compatibili con il sistema gateway, che forniscono ai ricercatori strumenti di facile utilizzo per eseguire sia saggi BFC che saggi ISTO two hybrid.

In questo video, mostreremo la semplicità d'uso del nostro sistema BFC. Per verificare le interazioni tra proteine in un sistema di espressione trascendentale, è necessario prima preparare la coltura batterica GV3101.

È necessario prelevare una singola colonia dalla propria piastra e inoculare in cinque millilitri di mezzo YEB con antibiotici appropriati. Successivamente, occorre agitare queste colture tutta la notte a 28 gradi. La velocità è di 200 giri al minuto.

Le colture batteriche dovrebbero essere pronte la mattina successiva. Assicurarsi che i batteri D siano cresciuti eccessivamente. Prelevare le colture dall'incubatore e trasferire un maschio di ciascuna coltura in un tubo sterile da centrifuga da 1,5 mL.

Inserire i tubi del centrifugato in una centrifuga da banco. Centrifugare i batteri a 1000 G per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il soprannatante. Quindi risospendere il pellet aggiungendo un millilitro di mezzo di infiltrazione e rimescolare per qualche volta.

Ripetere il passaggio di lavaggio altre due volte. Questo è importante perché aiuta a rimuovere le tracce di antibiotici nel mezzo batterico, che potrebbero compromettere le piante dopo l'infiltrazione. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 0,5 mL di mezzo di infiltrazione e misurare l'assorbanza a 600 nm di questa sospensione batterica utilizzando un fotometro a dispersione, con il mezzo di infiltrazione come bianco di controllo.

Dopo la misurazione dell'OD, è necessario aggiustare l'OD utilizzando il mezzo di infiltrazione. L'OD finale deve essere compreso tra 1 e 1,2. È consigliabile preparare tutte le sospensioni batteriche prima di passare al passaggio successivo.

Trasferire quantità uguali di sospensioni batteriche corrispondenti alle due proteine candidate e mescolarle in un nuovo tubo da 1,5 mL. La miscela batterica è ora pronta per l'infiltrazione. Preparare tutte le combinazioni e non dimenticare di includere un controllo negativo. Utilizzare da cinque a sei piante di *Nicotiana benthamiana* per l'infiltrazione.

È possibile rimuovere le piante dalla stanza di crescita e posizionarle sotto luce notturna per un'ora prima dell'infiltrazione, in modo da aprire gli stomati. Questo aiuterà il processo di infiltrazione. Aspirare circa 100 microlitri di batteri sospesi in Resus.

Mescolare con una siringa monouso da circa 1 ml senza ago. Appoggiare la punta della siringa sulla faccia inferiore della foglia. Sostenere il lato superiore della foglia con il dito.

Di solito premere verso il basso lo stantuffo. Si dovrebbe essere in grado di vedere il liquido diffondersi attraverso la foglia, poiché la mesofilla risulta più sottile. Dopo l'infiltrazione, contrassegnare con un pennarello la foglia infiltrata. In caso contrario, dopo due giorni non sarà possibile identificare la foglia infiltrata. Se si deve effettuare l'infiltrazione con miscele batteriche diverse, assicurarsi di spruzzare i guanti con etanolo al 50% o di cambiare i guanti tra un'infiltrazione e l'altra.

Cercare di lasciare uno spazio di un metro tra le infiltrazioni per prevenire la cross-contaminazione. I segnali di PFA devono essere monitorati ogni 24 ore a partire dall'infiltrazione fino a cinque giorni. È possibile utilizzare due guaine protettive di dimensioni diverse per tenere il campione.

Prima, mettere una goccia di acqua mini su un manicotto del coperchio scanalato. Poi tagliare un piccolo pezzo di tessuto di carta da cucina all'interno della zona infiltrata. Cercare di evitare la vena nauseante nel campione.

Posizionare il tessuto di coltello tagliato nell'acqua sul vetrino in basso, coprirlo utilizzando una piccola cuffia e premere delicatamente. Ora il campione può essere osservato al microscopio Mexico. Qui utilizziamo questo NACA T CSS P due microscopio confocale Mexico per visualizzare il segnale BIFC.

Anche un comune microscopio a fluorescenza può essere utilizzato. La microscopia confocale fornisce immagini migliori e permette di rilevare segnali deboli. È possibile utilizzare il parametro YFP per rilevare i segnali VFC in questo sistema NCAs P due.

È possibile fare semplicemente doppio clic su questo preset YFP qui, il che attiverà automaticamente l'eccitazione e imposterà l'intervallo di rilevamento dell'emissione. Se si utilizza un sistema diverso, consultare il manuale per impostare correttamente i parametri. Speriamo che, dopo aver visto questo video, siate in grado di eseguire la BFCE per testare le interazioni tra proteine utilizzando il sistema di espressione unbe MI Transcend.

È possibile applicare questo procedimento anche alle piante di tabacco e AY. I nostri vettori BFC contengono rispettivamente un marcatore HA e un marcatore flag, quindi è anche possibile eseguire un'immunoprecipitazione in co-presenza per validare le interazioni, se necessario.