Caratterizzazione del isolata, ventilata e polmone mouse Instrumented perfusi con flusso pulsatile

Per studiare le relazioni tra flusso e pressione polmonare pulsatile. Questo protocollo spiega come isolare, ventilare e perfondere i polmoni di topo. La trachea viene esposta chirurgicamente per la ventilazione.

Quindi il cuore e i polmoni vengono isolati in modo da poter cannuilare l'arteria polmonare e l'atrio sinistro. Il sistema polmonare viene quindi perfuso. Gli esperimenti vengono eseguiti modificando il flusso, l'entità, la forma d'onda e/o la frequenza dell'arteria polmonare.

I tracciati risultanti della pressione nell'arteria polmonare e nell'atrio sinistro vengono registrati e mostrano le relazioni tra flusso e pressione pulsatile nel circolo polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i preparati in vivo, è la possibilità di osservare variazioni nelle relazioni tra pressione e flusso. Le relazioni tra pressione e flusso pulsatile possono essere ottenute in assenza di modifiche dello stato di volume, del tono del sistema nervoso simpatico, dell'attività fisica e degli effetti dell'anestesia.

Inoltre, la maggior parte delle preparazioni polmonari isolate misura solo relazioni pressione-flusso stazionarie, mentre la nostra tecnica permette di determinare relazioni pressione-flusso pulsatile. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia polmonare, ad esempio in che modo la malattia vascolare polmonare influisce sull'emodinamica polmonare pulsatile, oppure in che modo l'indurimento dell'arteria polmonare principale influisce sul postcarico del ventricolo destro? Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'esposizione del cuore e dei polmoni e il posizionamento della cannula nell'arteria polmonare sono difficili da apprendere.

La pressione eccessiva derivante dagli strumenti può causare edema nei polmoni e un posizionamento improprio della cannula può perforare l'arteria polmonare. Prima di iniziare l'esperimento, è necessario preparare il sistema IL one utilizzato per ventilare e perfondere il polmone isolato. I tubi devono essere collegati ai trasduttori di pressione.

Utilizzando la pompa singola e il flussimetro, sciacquare completamente il sistema con acqua distillata riscaldata a 37 gradi Celsius ed eliminare eventuali bolle nei tubi. Quindi, preparare i tubi della pompa Endur tech con PBS al 1%. Ora azzerare.

La pressione per ogni trasduttore P 75 viene regolata chiudendo prima la valvola verso il sistema IL e aprendo la valvola verso l'atmosfera. Quindi utilizzare l'amplificatore plug SIS per azzerare automaticamente la pressione prima di preparare l'animale. Umidificare l'allestimento IO inzuppando il pezzo poroso in ceramica in acqua distillata. Dopo aver anestetizzato il topo, stabilizzarlo per l'intervento chirurgico fissando le zampe anteriori su un sughero.

Ora spruzzare sul torace l'alcol al 95%. Utilizzare pinze dritte per afferrare la pelle al collo ed effettuare un'incisione di un centimetro con le forbici dritte. Una volta esposta l'interno del collo, rimuovere il tessuto ghiandolare bianco dai muscoli superficiali cercando l'esofago e la trachea.

Isolare l'esofago e la trachea dal tessuto su entrambi i lati e posteriormente, quindi legare un punto di sutura lasso intorno alla trachea. Per cannuolare la trachea, tagliare con attenzione una piccola V su un lato con le forbici piccole. Portare ora il topo al sistema IL uno utilizzando pinze ottuse.

Prendere la cannula tracheale e inserirla nella trachea. Fissare la cannula con un punto di sutura. Iniziare la ventilazione con aria ambiente, spruzzare alcol sul torace ed eliminare la cute utilizzando pinze dritte e forbici dritte.

Tagliare la pelle in senso ascendente lungo lo sterno. Sollevare la pelle su ciascun lato e tagliare lungo la linea delle costole inferiori. A questo punto afferrare il processo xifoidi con una pinzetta e utilizzare forbici a punta arrotondata per praticare un foro nel diaframma nel punto in cui si incontra con l'estremità inferiore dello sterno.

Afferrare il diaframma e tagliarlo via dalle costole. Utilizzando forbici con punta a sfera, afferrare nuovamente il processo xifoidi e usare le forbici per tagliare con attenzione lungo lo sterno attraverso le costole, senza danneggiare i polmoni, il cuore o i vasi sanguigni. Per esporre il cuore, afferrare le costole sinistre e tagliarne le estremità.

Ora iniettare lentamente 0,1 millilitri di eparina nel ventricolo destro. Dopo l'iniezione, rimuovere il resto delle costole. Utilizzare la parte posteriore o l'estremità arrotondata della pinzetta per spingere delicatamente i polmoni lontano dalla costola mentre si tagliano le costole al microscopio. Rimuovere il tessuto ghiandolare presente nel grasso sopra il cuore.

Usare le pinzette per allontanare i tessuti e rimuoverli. Con le forbici a molla, posizionare un punto di sutura intorno all'aorta e all'arteria polmonare, quindi sollevare delicatamente il cuore con pinzette arrotondate. La resistenza dovrebbe essere minima.

Ora eseguire una sutura lassa con un doppio nodo. Successivamente, rimuovere l'addome inferiore. Utilizzare forbici angolate per tagliare attraverso le costole e la spina dorsale.

Questo provocherà un notevole afflusso di sangue. Utilizzare un bastoncino di ovatta per arrestare il flusso. Una volta interrotto il flusso ematico, preparare il sistema IL con quattro millilitri di RPMI da una siringa riempita con 10 millilitri di RPMI.

È consigliabile verificare attentamente che nel tubo non siano presenti bolle. Procedere ora con la cannuolazione del ventricolo destro praticando una piccola incisione vicino all'apice e inserendo la cannula. Orientare la cannula verso il basso, in direzione del ventricolo destro, fino a raggiungere l'arteria polmonare. La punta della sonda dovrebbe essere visibile attraverso la parete quasi trasparente dell'arteria polmonare.

Quindi stringere il punto intorno alla cannula, all'aorta e all'arteria polmonare per cannuolare il ventricolo sinistro. Praticare un intaglio all'apice e inserire la cannula orientandola verso l'alto, in direzione dell'atrio sinistro. Potrebbe essere necessaria una leggera pressione per individuare la valvola, ma una volta trovata, la cannula scivolerà attraverso di essa e rimarrà stabile senza bisogno di punti di sutura.

Infondere manualmente l'RPMI dalla siringa da 10 millilitri a 0,3 millilitri al minuto fino a quando non si osserva flusso nel tubo di efflusso. Se non c'è flusso nel tubo di efflusso, riposizionare la cannula del ventricolo sinistro. Tuttavia, se non c'è flusso nei polmoni, interrompere l'esperimento perché probabilmente l'arteria polmonare presenta una perdita.

Ora che il cuore è completamente cannullato, collegare la siringa da 60 millilitri al sistema IL uno. Utilizzando la pompa a flusso costante, infondere l'RPMI Perfuse otto a una velocità di un millilitro al minuto. Controllare la presenza di perdite durante la perfusione iniziale.

Perfondere gradualmente i polmoni per altri due minuti, durante i quali i polmoni diventeranno bianchi. Per studi su flusso pulsatile. Impostare innanzitutto lo spostamento del pistone della pompa singola ai livelli desiderati.

Quindi impostare la portata costante. Ora aprire la valvola della pompa osli e iniziare a registrare i dati immediatamente prima di eseguire il profilo di flusso osli. Al termine, aprire il file di output dei dati e tracciare il flusso sperimentale in base ai flussi sperimentali del test iniziale.

Regolare lo spostamento del pistone della pompa oscillante a ciascuna frequenza in modo che Q max sia quello desiderato. Mantenere la ventilazione a pressione costante. Durante l'acquisizione dei dati per le prove a flusso costante, chiudere la valvola della pompa singola e impostare il flusso costante al livello desiderato. Iniziare la registrazione dei dati ed eseguire il protocollo a flusso costante.

Raccogliere dati per almeno 10 secondi a ogni portata tra un esperimento e l'altro. Reimpostare la portata a 0,5 millilitri al minuto. Assicurarsi di mantenere la ventilazione a pressione costante durante la raccolta dei dati.

Se si desiderano prove con pressione atriale sinistra nulla, rimuovere il tubo di efflusso durante le prove. Controllare attentamente la presenza di RPMI nel tubo dell'aria. L'RPMI non deve assolutamente raggiungere i trasduttori di pressione delle vie aeree, altrimenti potrebbero danneggiarsi.

Di seguito sono riportati i risultati della perfusione con flusso costante con flusso Q nella riga superiore e le pressioni risultanti nell'arteria polmonare e nell'atrio sinistro nella seconda riga, in diverse condizioni. Nei primi due pannelli, la pressione nell'atrio sinistro è aumentata e diminuita con Q perché era presente il tubo di efflusso: nel primo pannello è mostrata la pressione aerea alla fine della inspirazione (pressione inspiratoria), mentre nel secondo è mostrata la pressione aerea alla fine della espirazione (pressione espiratoria). Successivamente, il tubo è stato rimosso in modo che la pressione nell'atrio sinistro fosse costante e indipendente da Q. Infine, l'altezza del tubo di uscita è stata regolata manualmente in modo da ottenere una pressione nell'atrio sinistro più elevata.

Ma indipendentemente da Q, il primo pannello mostra la pressione dell'aria alla fine, la pressione inspiratoria, e il secondo mostra la pressione dell'aria alla fine della espirazione. Le relazioni risultanti tra pressione e flusso nell'arteria polmonare per ogni caso possono essere ottenute tracciando la pressione in funzione del flusso.

Di seguito sono riportati i risultati della perfusione con flusso pulsatile, con il flusso Q nel pannello superiore e le pressioni risultanti nell'arteria polmonare, nell'atrio sinistro e nell'aria. Nel pannello inferiore. Da queste relazioni pressione-flusso polmonari pulsatile, può essere calcolata l'impedenza vascolare polmonare, che riflette il carico post del ventricolo destro.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20-30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prendersi il proprio tempo e rilassarsi in modo che le mani siano ferme. Una volta che i polmoni sono adeguatamente perfusi, la parte più difficile è superata.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche, come l'istologia o saggi biochimici sul tessuto polmonare, per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quali meccanismi molecolari sono responsabili dei cambiamenti osservati nelle relazioni tra flusso e pressione polmonare pulsatile. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia polmonare per esplorare il ruolo di geni e proteine specifici nello sviluppo e nella progressione delle malattie vascolari polmonari, utilizzando topi geneticamente modificati.