Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione
30 giugno 2014
La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l'imaging di fluorescenza in tempo reale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la permeabilità in singoli microvasi di polmoni di ratto isolati utilizzando un metodo basato sulla fluorescenza. Ciò si ottiene isolando prima i polmoni di ratto e perfondendoli con sangue autologo. La seconda fase della procedura consiste nell'inserire un microcatetere atriale sinistro in una piccola regione del polmone per infondere nella flora quattro destrine marcate.
Quindi, mentre la destrina marcata viene infusa, vengono raccolte le immagini dei microvasi polmonari. Il passaggio finale consiste nel quantificare la permeabilità dei singoli microvasi dalle immagini utilizzando il software. In definitiva, i risultati possono mostrare il grado di permeabilità dei microvasi polmonari in diverse condizioni, ad esempio dopo il trattamento con LPS.
A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Kava Kasami, una borsista post-dottorato del mio laboratorio Begin eseguendo una tracheotomia su un ratto maschio in un piano chirurgico di anestesia confermato. Utilizzare una cannula tracheale in PE 90 e fissarla con punti di sutura. Successivamente, infondere il cuore con 100-200 unità di eparina utilizzando un ago a farfalla calibro 21.
Aspetta un minuto e poi dissangua il sangue. Raccogli il sangue e mettilo da parte con la soluzione salina. Riempire due cannule fatte di tubo tigon da tre millimetri lunghe quattro centimetri e svasate su un'estremità.
Ora esegui una toracotomia. Praticare un'incisione abbastanza grande da far entrare la cannula nel ventricolo destro e farla scivolare nella tana svasata di una cannula verso l'arteria polmonare. Fissare la cannula con punti di sutura.
Usa la stessa tecnica per inserire l'altra cannula nell'apice del ventricolo sinistro verso l'atrio sinistro. Fissalo con nastro ombelicale largo due millimetri. Ora rimuovi i tessuti connettivi che ostacolano e rimuovi il lungo e il cuore insieme alle cannule.
Trasferiscili in una capsula di Petri con la superficie diaframmatica del polmone verso l'alto e le tre cannule tutte allineate. Spostare la preparazione sezionata su uno stadio regolabile dotato di tubi tigon numero 18 collegati a trasduttori di pressione che fungono da tubi di ingresso e uscita. Ora mescola la raccolta di sangue con un volume uguale di soluzione di albumina al 5%.
Aggiungere questa miscela al serbatoio di caricamento. Avviare la pompa a 14 millilitri al minuto. Assicurarsi che il tubo non abbia bolle d'aria.
Alla preparazione. Collegare l'arteria polmonare al tubo di ingresso del polmone e la cannula atriale sinistra al tubo di uscita. Ricontrollare che non ci sia aria nel tubo e controllare anche che lo shunt sia aperto.
Collegare la cannula tracheale a un terzo trasduttore di pressione. Gonfiare i polmoni attraverso la cannula tracheale con il 30% di ossigeno. Mantenere i polmoni a cinque centimetri di pressione dell'acqua.
Ora bloccare lo shunt e avviare la pompa a 14 millilitri al minuto. Per iniziare la perfusione polmonare durante la perfusione, regolare la pompa in modo da mantenere la pressione polmonare a circa 10 centimetri di acqua e mantenere la pressione atriale sinistra a tre centimetri di acqua. Inizia con la preparazione del polmone infuso di sangue.
Innanzitutto, costruire un catetere per infusione da un tubo PE 10 di 40 centimetri inserito in un tubo PE 90 di 30 centimetri. Collegare l'altra estremità del tubo PE 10 a un ago calibro 30 collegato a una siringa da un cc. Portare l'estremità del tubo attaccato al polmone sopra la preparazione e collegare il catetere per infusione ad esso.
Guidare il catetere per infusione nell'atrio sinistro e poi nel polmone fino a quando non incontra resistenza. Una forza eccessiva danneggerà il polmone. La corretta incisione del microcatetere è fondamentale in quanto qualsiasi danno al polmone da parte del microcatetere ridurrà il successo del protocollo.
Quindi, riempi la siringa con le suonerie e collegala a una pompa. Infondere lentamente la soluzione a una velocità di 10 microlitri al minuto. Gradualmente, il sito di infusione diventerà pallido rispetto al resto del polmone per mantenere la superficie polmonare umida e rapida nella plastica, ad eccezione del sito di infusione.
Ora per visualizzare il polmone, crea una finestra di visualizzazione attaccando un O-ring a un vetrino coprioggetti da 22 millimetri. Utilizzando grasso per rubinetti, fissare l'O-ring a un supporto per provette. Quindi posizionare la finestra sopra il sito di infusione.
Completa la configurazione facendo oscillare un obiettivo 20 x sopra il vetrino coprioggetti e concentrandoti sul polmone. Non è prevista alcuna distorsione visiva. Ora infondere il polmone con una soluzione a scelta.
In questo esempio, dopo la soluzione salina, un millilitro di destrina coniugata ZI viene infuso nel polmone attraverso la pompa a siringa nel corso di 60 minuti. Utilizzando il software di imaging, registrare un'immagine al minuto per l'infusione di un'ora e continuare la registrazione durante il successivo washout Passaggio per altri 10 minuti Dopo l'infusione della destrina Fitz, lavarla via infondendo la soluzione di suoneria polmonare per almeno altri 10 minuti alla stessa velocità di flusso. Dopo. Quando si analizzano le immagini acquisite, si ottiene l'intensità massima di fluorescenza nella regione di interesse durante l'infusione.
Quindi segnare l'intensità massima di fluorescenza della fluorescenza residua dopo il washout di 10 minuti. Le variazioni della permeabilità vascolare sono state studiate utilizzando l'infusione di destrina fitzy dopo il trattamento con lipopolisaccaride batterico, poiché questo è un modello ampiamente utilizzato di un LI.La fluorescenza residua di fit e era bassa nei microvasi trattati con ringer, ma alta in quelli trattati con LPS. Inoltre, rispetto all'infusione di ringer, l'infusione di LPS ha causato una significativa riduzione dell'indice di permeabilità, suggerendo un aumento globale della permeabilità in tutti i vasi all'interno del campo dell'immagine.
Inoltre, rispetto all'infusione di ringer, l'infusione di LPS ha causato una significativa riduzione dell'indice di permeabilità, suggerendo un aumento globale della permeabilità in tutti i vasi all'interno del campo dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i polmoni isolati per la profilassi degli uccelli, inserire un microcatetere della coda sinistra e definire la permeabilità nel micro.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per quantificare la permeabilità di singoli microvasi nei polmoni isolati di ratto mediante imaging fluorescente in tempo reale. Il preparato polmonare isolato perfuso con sangue consente la visualizzazione delle reti microvascolari sulla superficie del polmone.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia vascolare
- Immagini di fluorescenza
Sfondo
- Comprendere la permeabilità dei microvasi è fondamentale per lo studio della funzione polmonare.
- Le preparazioni polmonari isolate forniscono un ambiente controllato per gli esperimenti.
- L'imaging a fluorescenza consente l'osservazione in tempo reale della dinamica dei microvasi.
- Studi precedenti hanno dimostrato l'impatto di diversi trattamenti sulla permeabilità vascolare.
Scopo dello studio
- Quantificare la permeabilità in singoli microvasi di polmoni isolati di ratto.
- Utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per misurazioni accurate.
- Valutare gli effetti di condizioni come il trattamento con LPS sulla permeabilità dei microvasi.
Metodi Utilizzati
- Isolamento dei polmoni di ratto e perfusione con sangue autologo.
- Inserimento di un microcatetere atriale sinistro nel polmone.
- Infusione di destrina marcata con fluoresceina nei microvasi.
- Acquisizione di immagini durante il processo di infusione per l'analisi.
Risultati principali
- È stata ottenuta la quantificazione della permeabilità in singoli microvasi.
- I risultati hanno indicato diversi gradi di permeabilità in diverse condizioni sperimentali.
- L'imaging a fluorescenza ha fornito una chiara visualizzazione delle reti microvascolari.
- I dati sostengono ulteriori indagini sugli effetti dei trattamenti sui microvasi polmonari.
Conclusioni
- Il metodo quantifica efficacemente la permeabilità dei microvasi in polmoni isolati.
- L'immagine in tempo reale è uno strumento prezioso per la ricerca vascolare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle risposte vascolari polmonari a diversi stimoli.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una quantificazione diretta delle variazioni di permeabilità in singoli microvasi polmonari in condizioni infiammatorie, fornendo informazioni meccanicistiche sui percorsi di fuoriuscita vascolare. Combinando la perfusione polmonare isolata con imaging fluorescente in tempo reale, supporta la validazione di bersagli nei modelli di infiammazione polmonare e facilita la valutazione preclinica di candidati protettivi della barriera. L'approccio riduce la dipendenza dall'elaborazione dei tessuti a fine sperimentazione, accelerando l'acquisizione dei dati per decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Misura in tempo reale la fuoriuscita di fluidi attraverso segmenti venulari e capillari per verificare ipotesi terapeutiche nell'infiammazione vascolare.
- Valore operativo: Consente il confronto diretto delle risposte di permeabilità tra diversi letti vascolari all'interno dello stesso preparato polmonare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative dell'intensità di fluorescenza per valutare gli effetti dei composti sulla permeabilità dei microvasi.
- Valore operativo: Standardizza le condizioni di perfusione e di imaging per uno screening vascolare riproducibile e ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i cambiamenti di permeabilità indotti dal LPS ai meccanismi rilevanti per la malattia nell'insulto polmonare acuto.
- Valore operativo: Permette la modellizzazione dose-risposta e la correlazione farmacocinetica-farmacodinamica negli studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino ai test di efficacia preclinica, in particolare per modulatori del sistema vascolare polmonare.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando la funzione della barriera vascolare in risposta a stimoli infiammatori.
- Screening: Fornisce output pronti per il saggio e quantificabili per valutare gli effetti dei composti sulla permeabilità di singoli vasi.
- Analisi: Offre calcoli dell'indice di permeabilità derivati da immagini in time-lapse per consentire l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le risposte microvascolari a modelli preclinici di danno polmonare mediante stimolazione con LPS.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la permeabilità vascolare in diversi classi di composti e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di fuoriuscita vascolare grazie a una risoluzione diretta a livello di singolo vaso.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di infusione con microcatetere e di imaging per garantire riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo fornendo precoci segnali quantitativi sulla sicurezza vascolare.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati basata sugli effetti vascolari polmonari, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia su roditori, cannullatura vascolare e microscopia a fluorescenza.
- È dipendente da sistemi di perfusione regolati dalla pressione e da infrastrutture per l'imaging intravitale.
- Necessita della standardizzazione delle velocità di infusione, delle concentrazioni di fluorocromo e dei protocolli di lavaggio tra diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento ad altre specie o modelli di malattia potrebbe richiedere la validazione dei parametri di perfusione e dell'accessibilità vascolare.
- I limiti pratici includono la complessità tecnica del posizionamento del microcatetere e il potenziale trauma polmonare derivante dalla cannullatura.
