Solida piastra a base di restrizioni alimentari, Caenorhabditis elegans

La procedura esegue una restrizione dietetica sulla piastra standard a base di agar nel nematode *C. elegans* per studiarne gli effetti sulla longevità, sulla riproduzione e sul metabolismo. Questo viene ottenuto misurando con precisione la concentrazione dei batteri che verranno utilizzati come fonte alimentare. Il secondo passaggio della procedura consiste nel diluire correttamente la coltura batterica in concentrazioni adeguate.

Quindi preparare piastre SDR con batteri uccisi. Infine impostare esperimenti SDR con una popolazione di vermi sincronizzata per età. I risultati delle misurazioni della produzione di prole e della durata della vita possono mostrare una produzione di prole ritardata e ridotta, nonché un aumento della durata media della vita.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a 60 metodi come Dian in mezzo AZA è che l'intero esperimento verrà eseguito su un comune terreno solido a base di AGA utilizzato dalla maggior parte dei laboratori che lavorano con organismi termofili. Per esperimenti di restrizione dietetica e per stabilire elegans, è necessario preparare curve di calibrazione distinte per ciascun ceppo batterico impiegato come fonte alimentare. Prelevare una singola colonia del batterio e coli OP50 da una piastra appena rigata su agar lb e inoculare tre millilitri di coltura liquida in brodo lb, coltivando in agitazione a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Preparare diluizioni seriali a due fold della coltura ottenuta dopo la notte.

Quindi misurare l'assorbanza di ogni diluizione a 600 nanometri mediante spettrofotometro in triplice replicato. Diluire ulteriormente ogni sospensione batterica di un milione di volte e seminare uniformemente 0,4 millilitri di sospensione batterica di ciascuna diluizione su una piastra in agar LB da 100 millimetri, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 18-24 ore. Contare il numero di colonie batteriche sviluppatesi su ciascuna piastra al fine di calcolare le unità formanti colonie per millilitro per ogni campione.

Ora tracciare l'OD 600 in funzione della concentrazione batterica ed eseguire un'analisi di regressione lineare per stabilire la relazione tra i valori di OD 600 misurati e le concentrazioni di batteri OP 50. Per questo metodo, si utilizza una concentrazione batterica di 1 × 10¹¹ UFC/mL nella condizione di alimentazione ad libitum e di 1 × 10⁸ UFC/mL come condizione ottimale di alimentazione DR. Tuttavia, potrebbero essere necessarie da quattro a sei diverse concentrazioni batteriche per stabilire una relazione completa dose-dipendente.

Per SDR e le sue risposte. Preparare un inocolo con una singola colonia di batteri e coli OP 50 in tre millilitri di brodo LB liquido, coltivati in un agitatore a 37 gradi Celsius per sei-otto ore. Trasferire la coltura OP 50 in un nuovo flacone contenente 500 millilitri di brodo LB e far crescere durante la notte affinché i batteri raggiungano la saturazione, se necessario.

Preparare un'opportuna diluizione della coltura OP 50 per la misurazione dell'assorbanza a OD 600. Per determinare la concentrazione batterica, formare il pellet dei batteri mediante centrifugazione a 1500 G per 20 minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere i batteri a una concentrazione di 1 × 10¹² UFC per millilitro.

Ora, preparare colture batteriche da 10 millilitri in sei concentrazioni diverse, comprese tra 1 × 10¹² e 1 × 10⁷ UFC per millilitro. Pipettare 0,2 millilitri di coltura batterica al centro di una piastra N GM solidificata da 60 millimetri. Evitare di toccare la superficie della piastra con la punta della pipetta, poiché i graffi sulla superficie permettono ai vermi di scavare all'interno degli aerati.

Posizionare le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, applicare 10 microlitri di soluzione di carbonico a 100 milligrammi per millilitro e 10 microlitri di canamicina a 50 milligrammi per millilitro su ciascuna piastra per inibire la crescita dei batteri. Conservare le piastre con diverse concentrazioni di antibiotico che hanno ucciso i batteri a quattro gradi Celsius per un utilizzo futuro fino a un mese.

È importante preparare e conservare un numero sufficiente di piastre, preferibilmente della stessa partita per l'intero esperimento. Eseguire una prova almeno uno o due giorni prima per verificare la vitalità dei batteri. Prelevare alcuni batteri dalle piastre SDR e distribuirli su una piastra N GM vuota con acido carbonico, sein e antimicina.

Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per sei-otto ore e verificare l'assenza di crescita batterica. Per la maggior parte degli studi relativi alla SDR, come l'analisi della durata della vita e il profilo della produzione di prole, è essenziale preparare una popolazione di vermi sincronizzata per età. Utilizzare un prelevatore di vermi in platino per trasferire da 20 a 30 adulti riproduttivamente attivi su diverse piastre NGM standard.

Con OP 50. A seconda del numero di uova necessarie per gli esperimenti, potrebbero essere necessari più adulti. Lasciare le piastre a 20 gradi Celsius per quattro ore per consentire la deposizione delle uova.

Rimuovere gli adulti dalla piastra e ispezionare visivamente le piastre alla ricerca di uova. Continuare l'incubazione delle piastre a 20 gradi Celsius per permettere alla prole di svilupparsi fino allo stadio adulto tardivo L4-giorno uno. Di solito, questo richiede tre giorni per i vermi di tipo selvatico N2 a 20 gradi Celsius.

Per l'analisi della durata della vita. Trasferire da 10 a 12 vermi adulti di un giorno su una piastra SDR per avviare la restrizione dietetica. Per ottenere un potere statistico sufficiente, utilizzare un totale di da 60 a 100 vermi per ciascuna condizione SDR.

Valutare la vitalità di ciascun verme ogni due o tre giorni fino a quando tutti i vermi non sono morti. È importante trasferire i vermi su piastre SDR fresche ogni due giorni per evitare la fame. Questa curva di calibrazione riporta la concentrazione di OP 50 in relazione all'OD 600.

L'equazione generata dall'analisi di regressione lineare può essere utilizzata per tutti i futuri calcoli delle concentrazioni batteriche di OP 50. Questo studio analizza l'effetto di trattamenti cronici con SDR sulla durata media della vita di diverse ceppi di vermi, in confronto alla risposta dipendente dalla dose normale dei vermi di tipo selvatico all'SDR. L'effetto dell'SDR sulla durata della vita è parzialmente soppresso dall'overespressione di DR due, mentre la mutazione DAF 16 MU 86 non ha alcun effetto sull'allungamento della durata della vita indotto dall'SDR.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire Dian sul gioco standard basato su AGA in sea elegance.