Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare le propensioni alla ligamentizzazione di proteine, domini transmembrana o domini TM in un ambiente membranario naturale. Questo viene ottenuto esprimendo il dominio transmembrana di interesse in *E. coli* come proteina chimerica con la proteina legante il maltosio per il targeting al periplasma e ToxR come reporter trascrizionale; la ligamentizzazione indotta dal dominio transmembrana provoca il dimerizzazione di ToxR e l'attivazione della trascrizione di LXi. In un secondo passaggio, le cellule vengono lisate e trattate con ONPG, che viene idrolizzato dalla beta-galatto alla specie assorbente alla luce, o-nitrofenolato o ONP.

I livelli successivi di ONP vengono quantificati misurando l'assorbanza della luce a 405 nanometri. Per determinare i livelli di dominio transmembrana, i risultati della legamentizzazione rivelano la propensione alla legamentizzazione dei domini transmembrana in base a un saggio con reporter tox R. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi biofisici esistenti, come la SDS-PAGE o la fluorescenza, è che il comportamento del dominio transmembrana viene studiato in un doppio strato fosfolipidico naturale mediante espressione in E. coli, piuttosto che in un sistema mimetico della membrana come un detergente.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle proteine di membrana, come l'elucidazione delle principali caratteristiche strutturali coinvolte nell'associazione delle eliche transmembrana. Prima dell'inizio di questo protocollo, si preparano sette plasmidi che esprimono la proteina chimera richiesta, ottenuti da oligonucleotidi sintetizzati commercialmente, rappresentanti il dominio di interesse delimitato da NHE1 e BMH1. Dopo aver preparato i plasmidi, scongelare delicatamente le cellule competenti fhk12 sul ghiaccio. Una volta scongelate, trasferire le cellule in provette da coltura da 15 millilitri, aggiungendo 200 nanogrammi di ciascun DNA plasmidico in provette separate e incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti.

Quindi sottoporre le cellule a shock termico per 90 secondi a 42 gradi Celsius, seguito da un'incubazione su ghiaccio per due minuti in 800 microlitri di mezzo SOC e incubare i campioni a 37 gradi Celsius con agitazione per un'ora; dopo l'incubazione, inoculare cinque millilitri di mezzo LB contenente cloramfenicolo e aose con 50 microlitri della miscela di trasformazione utilizzando provette da coltura da 15 millilitri in triplice replicato per ogni campione. Infine, incubare i campioni a 37 gradi Celsius con agitazione per 20 ore. Per misurare la totalità della ligamentizzazione, l'attività della beta-galattosidasi TDS viene determinata.

Prima di tutto, preriscaldare il lettore di piastre a 28 gradi Celsius. Utilizzare la soluzione madre Z per preparare soluzioni fresche di tampone Z come descritto nel protocollo scritto. Trasferire il cloroformio del tampone Z dal tubo al serbatoio, assicurandosi di prelevare solo lo strato acquoso superiore del cloroformio del tampone Z.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un foglio di carta con una griglia disegnata per garantire un trasferimento accurato con la pipetta: aggiungere 100 microlitri di tampone Z con cloroformio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, seguiti da cinque microlitri di ciascuna coltura in quadruplicato. Omettere la coltura nei quattro pozzetti che fungeranno da bianchi. Misurare l'OD 5 95 della piastra per determinare la densità cellulare.

Aggiungere 50 microlitri di tampone Z SDS in tutti i pozzetti della piastra. Quindi agitare la piastra nel lettore di piastre per 10 minuti per lisare le cellule dopo la lisi cellulare con 50 microlitri di ZPA per ONPG in tutti i pozzetti. Riposizionare la piastra nel lettore di piastre e misurare l'OD a 405 ogni 30 secondi per 20 minuti.

Determinare il livello di attività della beta-lattamasi mediante il calcolo delle unità di Miller, normalizzando rispetto al bianco. Si esegue un'analisi mediante Western blot per verificare un'espressione proteica equivalente tra i diversi costrutti. In primo luogo, unire 50 microlitri delle colture in triplicato, quindi centrifugare i campioni utilizzando una microcentrifuga.

Rimuovere il soprannatante per pipettaggio e risospendere. Sospendere il pellet residuo in due volumi di buffer di caricamento del campione, caricare 7,5 microlitri di ogni campione su un gel standard all'8% ed eseguire l'elettroforesi a 125 volt per un'ora e cinque minuti dopo il trasferimento. Incubare la membrana con l'anticorpo anti M-V-P-H-R-P coniugato per visualizzare la proteina chimera, che appare a circa 70 chilodalton, con alcuni prodotti di degradazione talvolta visibili intorno a 48 chilodalton.

Il MVP endogeno viene osservato anche a 45 kilodalton. Per valutare un corretto inserimento nella membrana del costrutto chimerico con dominio transmembrana, viene utilizzata la linea cellulare PD 28 priva della proteina legante il maltosio, che, quando coltivata in terreno minimo con il maltosio come unica fonte di carbonio, permette la crescita solo a cellule che esprimono un prodotto di espressione integralmente membranare con la proteina legante il maltosio correttamente localizzata nel periplasma. Trasformare le cellule PD 28 come descritto per le cellule fhk 12 e inoculare due millilitri di terreno LB.

Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con agitazione a 300 giri al minuto durante la notte dopo l'incubazione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lavarle sospendendole in due millilitri di PBS e pipettando delicatamente con una punta grande. Dopo la raccolta, lavare nuovamente le cellule con PBS per la seconda volta, quindi eseguire una centrifugazione finale e sospensione in un millilitro di PBS.

Utilizzare 25 microlitri di cellule risospese per inoculare cinque millilitri di terreno minimo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con agitazione per 15 ore. Trasferire 200 microlitri di ogni campione in una piastra a 96 pozzetti e registrare la lettura dell'OD a 595 nm utilizzando il lettore di piastre.

Ripetere questo processo ogni due ore fino a 25 ore. La propensione alla ligamentizzazione di singoli domini transmembrana della proteina integrale di membrana con più passaggi, nota come proteina latente della membrana uno, è stata analizzata mediante il saggio del reporter trascrizionale ToxR. Il dominio transmembrana cinque mostra una forte propensione a ligamentizzarsi, come dimostrato da elevati valori di unità di Miller, paragonabili a quelli del controllo positivo GPA, una sequenza dimerizzante ben consolidata.

Una mutazione dannosa nel dominio transmembrana cinque D uno 50 A riduce la capacità della sequenza di attivare completamente LMP uno; TM uno non attiva in modo significativo e mostra un segnale molto basso in unità di Miller appena superiore al segnale del bianco, costituito da cellule FHK 12 non trasformate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare se un'elica transmembrana di interesse possiede la capacità di formare complessi di ordine superiore in un ambiente naturale di membrana. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante pipettare con estrema attenzione nella piastra a 96 pozzetti per evitare errori elevati e assicurarsi che non vengano introdotte bolle d'aria.