Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e quantificare il pool di tossina che entra nel citosol. Per raggiungere questo scopo, la tossina viene innanzitutto legata alla superficie della cellula ospite a quattro gradi Celsius. La tossina non legata viene quindi rimossa e le cellule vengono riscaldate a 37 gradi Celsius, consentendo il movimento della tossina all'interno del sistema endomembranare e successivamente nel citosol dell'ospite; viene quindi utilizzato il dig tonin per permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica dopo il passaggio attraverso la cellula.

I estratti cellulari vengono separati in frazioni membranari e citosoliche distinte mediante centrifugazione differenziale come passaggio finale; la risonanza di superficie plasmatica (SPR) abbreviata SBR viene utilizzata per rilevare e quantificare l'ingresso della tossina nel citosol, attraverso la perfusione della frazione citosolica su un sensore SPR rivestito con un anticorpo antitossina. Questo metodo contribuirà a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle tossine, come l'efficienza e la cinetica dell'ingresso della tossina nel citosol, la quantità di tossina che penetra nel citosol e l'eventuale inibizione farmacologica del trasporto della tossina verso il citosol. Prima di iniziare questo protocollo, preparare le cellule Heli per l'intossicazione cellulare come descritto nel protocollo scritto, a seguito di un'incubazione notturna delle cellule Hela.

Sostituire il mezzo di coltura con un millilitro di DMEM contenente 100 nanogrammi per millilitro di ganglioside GM1 e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Questo incrementa il numero di siti di legame per la tossina colerica. Poiché i gangliosidi GM1, recettori delle tossine, si inseriscono nella membrana plasmatica delle cellule esposte a una soluzione di GM1.

Dopo un'incubazione di un'ora, rimuovere il mezzo GM e lavare le cellule due volte con DMEM. Quindi aggiungere un millilitro di DMEM contenente un microgrammo per millilitro di tossina colerica e collocare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere il mezzo contenente la tossina e lavare le cellule due volte.

Quindi incubare le cellule in un millilitro di DMEM a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato. Al termine di ogni periodo di chase, lavare le cellule con PBS e successivamente incubare ogni pozzetto con 250 microlitri di EDTA 0,5 millimolare in PBS. Dopo un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio, rimuovere le cellule dalla piastra a sei pozzetti mediante vigorosa aspirazione con una pipetta P1000.

Dopo aver raccolto le cellule da una pozzetta, combinarle con la seconda e poi con la terza pozzetta della stessa condizione. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare combinata dalle tre pozzette replicate in un singolo tubo da microcentrifuga. A questo punto, centrifugare il tubo da microcentrifuga in una microcentrifuga da banco per cinque minuti.

Per tutte le condizioni, si dovrebbero ottenere pellet cellulari di dimensioni approssimativamente equivalenti a 5.000 ×g. Eliminare il soprannatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di una soluzione operativa allo 0,04% precedentemente preparata e refrigerata di digitonina. Porre la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti; quindi, utilizzando una microcentrifuga da banco, centrifugare la digitonina e le cellule permeabilizzate a 16.000 ×g per 10 minuti.

Trasferire il citosol contenente la frazione soprannatante in una nuova provetta da microcentrifuga e conservare la frazione pellettata contenente gli organelli. Gli standard della tossina SPR vengono preparati alle concentrazioni di centoundici, uno e 0,1 nanogrammi per millilitro in tampone HCN. I campioni vengono preparati diluendo le frazioni soprannatanti contenenti citosol in tampone HCN fino a un volume finale di un millilitro. Sono necessari volumi campione di almeno un millilitro per garantire che l'aria venga espulsa dal loop campione da 500 microlitri prima dell'iniezione. Le frazioni pellettate contenenti organelli vengono risospese in un millilitro di tampone HCN contenente il 1% di Triton X-100.

L'aggiunta di detergente è necessaria per rilasciare il pool di tossina racchiuso nella membrana. Inoltre, preparare contemporaneamente set paralleli di frazioni citosoliche e organellari per un esperimento di controllo volto a confermare l'affidabilità della procedura di frazionamento; risospendere la frazione citosolica in 20 microlitri di tampone campione 4x e la frazione organellare in 120 microlitri di tampone campione 1x. Risolvere volumi equivalenti di ciascuna frazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE) e analizzare tramite immunoblotting per dimostrare la distribuzione di una proteina citosolica nella frazione soprannatante e di una proteina solubile del reticolo endoplasmatico nella frazione pellet. Per preparare la lametta SPR, posizionare innanzitutto una lametta di vetro placcata d'oro, rivestita con uno strato autoassemblato, all'interno dello strumento SPR.

Attivare la diapositiva del sensore perfundendo una soluzione E-D-C-N-H-S sulla diapositiva per 10 minuti a una portata di 41 microlitri al minuto. Per tutte le successive perfusioni, utilizzare la stessa portata. Rimuovere il tampone di attivazione E-D-C-N-H-S lavando la piastra per cinque minuti con PBS contenente 0,05%2020.

La piastra contiene ora leganti reattivi di MI a causa della rimozione del cappuccio da parte della soluzione E-D-C-N-H-S. Successivamente, perfondere un anticorpo anti-CTA sulla lametta sensore attivata in un rapporto di diluizione di uno a 20.000 in acetato di sodio 20 millimolare per 15 minuti. Si osserverà un calo iniziale nell'unità di indice di rifrazione, abbreviata RIU, dovuto al cambiamento di pH.

Questo sarà seguito da un aumento dell'RIU poiché l'anticorpo viene catturato dai legami reattivi amidici. Sul vetrino del sensore, rimuovere l'anticorpo non legato mediante un lavaggio con PBST della durata di cinque minuti. Il segnale RIU prodotto dall'anticorpo catturato raggiungerà una fase di plateau e si stabilizzerà, fornendo un nuovo segnale di baseline.

Come passaggio finale nella preparazione della lamella, perfondere etanolammina 1 M sulla lamella sensibile per cinque minuti. Questo passaggio satura e inattiva eventuali leganti non legati rimasti sulla lamella sensibile. Il segnale RIU aumenterà per stabilire una lettura di base; perfondere PBST sulla lamella sensibile rivestita con anticorpo per cinque minuti.

Quindi, perfondere un campione sperimentale o uno standard di tossina sul sensore per 300 secondi. Rimuovere il ligando dal buffer e perfondere PBST sul sensore per altri 200 secondi. Eventuale tossina rimasta legata al sensore viene rimossa mediante un ulteriore lavaggio con PBST a pH 5,0.

Questo ripristinerà il segnale al valore iniziale della linea di base, consentendo così l'elaborazione di un altro campione sullo stesso sensore. Prima di caricare un nuovo campione, spingere una piccola quantità di aria attraverso il loop del campione per espellere qualsiasi fluido residuo del campione precedente. Dopo l'acquisizione.

I dati possono essere analizzati con il software Scrubber due e il software Igor può essere utilizzato per la preparazione delle figure. La tossina della pertosse è una tossina di tipo AB che si sposta dalla superficie cellulare fino al reticolo endoplasmatico prima che la sua catena a. PTs uno entri nel citosol.

Il saggio di traslocazione basato sulla SPR potrebbe rilevare le PT nel citosol delle cellule CHO intossicate. Nessun segnale è stato generato dal citosol delle cellule non intossicate, confermando l'assenza di PT. Un anticorpo non ha mostrato reazione incrociata con alcun componente del citosol dell'ospite.

La frazione citosolica di cellule intossicate in presenza di felden. A non ha prodotto anche un segnale positivo, BFA impedisce il trasporto della tossina al sito di translocazione nel reticolo endoplasmatico e quindi il rilascio della catena H nel citosol. La colera tossina è un'altra tossina di tipo AB che si transloca nel reticolo endoplasmatico.

CTA uno è stato rilevato nella frazione citosolica di cellule helo trattate con CT. Ciò ha evidenziato che la metodologia funziona con diversi tipi cellulari ed è applicabile a qualsiasi tossina per la quale sia disponibile un anticorpo anti-catena. Nessun segnale è stato rilevato quando la frazione citosolica proveniente da cellule trattate con CT è stata fatta passare su un sensore SPR rivestito con un anticorpo anti-CTB, dimostrando così che, a differenza del sottounità CTA uno, il pentamero CTB responsabile del legame cellulare non entra nel citosol.

Dopo il passaggio su un sensore SPR rivestito con un anticorpo anti-CTA. Il segnale della frazione organellare è fuori scala rispetto al segnale più debole della frazione citosolica. Questo è coerente con l'inefficienza nota del trasporto della CT verso il sito di translocazione nel reticolo endoplasmatico, il che a sua volta limita la quantità di tossina che può raggiungere il citosol.

È inoltre possibile monitorare l'accumulo dipendente dal tempo della tossina citosolica traslocata. Dopo l'esposizione delle cellule alla CT a quattro gradi Celsius, nessuna tossina è stata rilevata nel citosol 15 minuti dopo il riscaldamento a 37 gradi Celsius.

Un piccolo accumulo di tossina citosolica è stato rilevato dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius e quantità progressivamente maggiori di tossina citosolica sono state rilevate dopo i periodi di caccia di 45 e 60 minuti. Questo dimostra un rilascio continuo a lungo termine della tossina associata alla cellula nel citosol ospite. Il saggio può inoltre rilevare l'inibizione della traslocazione della tossina nel citosol: cellule trattate con DMSO al 10% hanno mostrato livelli bassi di CT simile al citosol rispetto alle cellule di controllo intossicate non trattate, con conseguente svolgimento della tossina.

Una catena è un prerequisito per la traslocazione nel citosol, quindi la stabilizzazione indotta da DMSO della CT A1 ha di conseguenza impedito il suo spostamento dal reticolo endoplasmatico al citosol. Per quantificare il blocco della traslocazione della tossina indotto da DMSO, è stata utilizzata una curva standard generata da concentrazioni note di tossina per calcolare una concentrazione citosolica di cta1 pari a 0,3 nanogrammi per millilitro nelle cellule non trattate e a 0,1 nanogrammi per millilitro nelle cellule trattate con DMSO. L'inibizione dello svolgimento della CT A1 da parte del DMSO ha pertanto determinato una riduzione di tre volte nella traslocazione da reticolo endoplasmatico a citosol della CT A1.

Seguendo questa procedura, saremo in grado di utilizzare altre tecniche, come i saggi di intossicazione, per stabilire un collegamento diretto tra la quantità di tossina presente nel citosol e l'attività della tossina.