High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

Questo video illustra un metodo per coltivare e distribuire ceppi fluorescenti di CL gans per lo screening ad alto rendimento di librerie chimiche o per la rilevazione di contaminanti ambientali, al fine di valutare l'effetto di agenti chimici o ambientali sull'attività di proteine specifiche. In CL elgan, le colture batteriche vengono inizialmente preparate come fonte alimentare per i vermi e per i vermi transgenici GFP. I vermi sincronizzati vengono coltivati.

Da 0,5 a 2 milioni di vermi vengono quindi raccolti, lavati e distribuiti in 3 piastre microtitolazione da 84 pozzetti, quindi vengono aggiunte molecole di piccole dimensioni da una libreria chimica o campioni di prova come acqua, cibo o suolo. Infine, la fluorescenza dei vermi viene misurata mediante un lettore di micropiastre.

L'analisi dei dati delle intensità di fluorescenza rivela piccole molecole che modulano vie di trascrizione induttibili o consente la rilevazione di contaminanti ambientali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi in vitro e quelli basati su colture cellulari, è che non si perderà tempo con composti tossici o inattivi in vivo. Questo metodo ad alto rendimento può aiutare a identificare piccole molecole che modulano diverse vie induttibili.

Benché abbiamo sviluppato questo metodo per lo screening ad alto rendimento di librerie di piccole molecole, può essere applicato anche al biosensing di contaminanti in campioni alimentari e ambientali. La procedura sarà dimostrata da Andrew Dine, tecnico del mio laboratorio, e Q long, ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Preparare in anticipo il cibo batterico per i vermi.

Iniziare inoculando 500 millilitri di terrific broth, integrati con 50 microgrammi per millilitro di streptomicina, con cinque millilitri di e coli OP 50 saturo. Posizionare la coltura su un agitatore e far crescere tutta la notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, suddividere la coltura in 10 provette da 50 millilitri. Quindi posizionare le provette in una centrifuga refrigerata e centrifugare a 2.500 RCF per 20 minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere ogni pellet batterico in 10 millilitri di terreno liquido per la crescita di nematodi o NGM.

Agitare orizzontalmente le sospensioni. Utilizzare un agitatore da pavimento per 15 minuti per risospendere i batteri. Successivamente, centrifugare la coltura batterica a 2.500 RCF a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Decantare l'NGM e pesare il pellet batterico. Quindi aggiungere un volume uguale di tampone NGM e risospendere i pellet mediante vortex. Infine, aliquotare tre millilitri della coltura batterica risospesa in provette da 15 millilitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

In questa dimostrazione, verrà misurato l'effetto dello stress indotto dal Xeno Duke loan sul fattore di trascrizione Sskn one, a titolo esemplificativo. È noto che Sskn one attiva geni citoprotettivi durante lo stress ossidativo e xenobiotico. Viene preparata una coltura su larga scala della linea Trenchgenic c gans VP 5 96, che contiene due costrutti fluorescenti.

I vermi VP 5 96 esprimono sia il promotore GST four che guida GFP, utilizzato per monitorare l'attività del fattore di trascrizione Sskn uno, sia il promotore DOP three che guida RFP, utilizzato come standard per la normalizzazione del numero di vermi.

DOP tre è il promotore per un recettore della dopamina ed è costitutivamente espresso nei neuroni in tutto l'organismo. Nell'esempio, poiché lo xenobio lon attiva fortemente sskn uno e aumenta la quantità di GFP espressa dal promotore GS T quattro, per preparare le colture iniziare mescolando 150 millilitri di tampone N NGM, 1,5 millilitri di LB 150, microlitri di colesterolo uno molare e 75 microlitri di streptomicina 100 milligrammi per millilitro. L'aggiunta del LB aiuta a impedire ai vermi di aderire alla vetreria e alla plastica, ma questa quantità non è sufficiente a sostenere la crescita batterica.

Filtrare la miscela per sterilizzarla, quindi trasferirla in un flacone sterile da un litro e mettere da parte il flacone per liberare le uova dai vermi adulti GR. Lavare i batteri dai vermi centrifugandoli e sostituendo il mezzo NGM fino a quando il sopranatante non diventa limpido. Lavare i vermi una seconda volta risospendendoli in acqua sterile, quindi centrifugare nuovamente dopo la risospensione.

Rimuovere il sopernatante e riempire il tubo con 3,75 millilitri di acqua sterile. Aggiungere un millilitro di candeggina domestica e 250 microlitri di idrossido di sodio 10 normal, mescolando immediatamente capovolgendo il tubo da cinque a sei volte. Posizionare il tubo su un agitatore rotatorio dopo che i vermi sono stati esposti alla candeggina per quattro minuti.

Posizionare il tubo sotto un microscopio stereoscopico. La maggior parte degli adulti dovrebbe essere distesa. Agitare vigorosamente il tubo da 15 a 20 volte per favorire la distensione di eventuali vermi adulti rimanenti dopo la lisi; dopo un tempo totale di cinque minuti, aggiungere acqua sterile fino a riempire il tubo.

Mescolare mediante inversione da cinque a sei volte per raccogliere le uova. Centrifugare il tubo per un minuto a 500 RCF. Lavare le uova tre volte mediante Resus, sospensandole in 10 millilitri di acqua sterile, centrifugando ed eliminando il soprannatante.

Successivamente, diluire un campione di 100 microlitri di uova di 100 volte aggiungendo 10 millilitri di tampone NGM. Quindi, pipettare tre aliquote di cinque microlitri ciascuna su un coperchio di piastra di Petri sotto un microscopio. Contare il numero di uova in tre aliquote separate da cinque microlitri.

Per stimare il numero totale di uova, aggiungere da 200.000 a 2 milioni di uova al matraccio con tampone NGM e agitare la coltura a 100 giri al minuto a 20 gradi Celsius. Almeno 16 ore dopo l'aggiunta delle uova al matraccio, utilizzare una pipetta sierologica sterile per prelevare circa 0,5 millilitri della coltura di vermi in sospensione.

Deporre con pipetta tre gocce da cinque microlitri sul coperchio sterile di una piastra di Petri. Posizionare il coperchio in un congelatore a meno 20 gradi per uno o due minuti per paralizzare i vermi; una volta paralizzati i vermi, contare il numero medio di vermi vivi schiusi ogni cinque microlitri utilizzando un microscopio stereoscopico per stimare il numero totale.

Scongelare la coltura batterica OP 50 congelata preparata in precedenza lasciandola a temperatura ambiente per alcuni minuti. Aggiungere quindi tre millilitri di OP 50 al 50% per ogni 500.000 worm appena schiusi. Agitare il matraccio a 100 giri al minuto a 20 gradi Celsius.

I vermi si svilupperanno in larve di quarto stadio e giovani adulti in circa 51 ore. Monitorare la quantità di batteri durante l'incubazione mediante ispezione visiva. Aggiungere ulteriori batteri se il mezzo diventa chiaro.

Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire circa 0,5 millilitri della coltura di vermi sospesa su una piastra standard in agar NGM. Osservare i vermi con un microscopio stereoscopico per verificare che la maggior parte siano larve di stadio L4 e giovani adulti in microscopia a campo chiaro; le larve L4 presenteranno una zona chiara ventrale al centro del corpo. I giovani adulti saranno leggermente più grandi e non avranno una zona chiara.

Successivamente, aspirare la coltura di vermi in provette sterili da 50 millilitri. Posizionare le provette in un portaprovette all'interno della cappa e lasciarle riposare in modo da far sedimentare le uova non schiuse o i vermi non sviluppati, che sedimentano più lentamente rispetto ai vermi sviluppati.

Dopo 10 minuti, rimuovere il soprannatante, che contiene vermi non schiusi e non sviluppati, aspirando circa 10 millilitri di tampone NGM per ogni pellet e sospendere i vermi agitando delicatamente i tubi. Raccogliere tutti i vermi in un unico tubo da 50 millilitri. Centrifugare nel centrifugatore con rotor swinging bucket a 500 RCF per 30 secondi.

Quindi risospendere i vermi in 50 millilitri di NGM con 1% di lb per lavarli. Ripetere questa operazione, effettuando da tre a quattro lavaggi, per rimuovere i batteri dopo il lavaggio. Riempire il tubo con NGM più tampone LB fino a 50 millilitri.

Versare questo in un flacone personalizzato per la distribuzione di vermi contenente un’asta magnetica e posizionarlo su un agitatore magnetico. È necessaria una quantità minima di circa 20 millilitri o 60.000 vermi per riempire lo spazio morto del flacone di distribuzione e della cassetta del distributore. Contare il numero di vermi in tre gocce da cinque microlitri come mostrato in precedenza.

Dopo il conteggio in NGM più LB, per una concentrazione di 12-15 vermi per goccia di cinque microlitri, ogni piastra da 84 pozzetti richiede circa 35.000 vermi o 11,5 millilitri di vermi sospesi. Inserire una cassetta dosatrice da 10 microlitri nell'erogatore e sterilizzarla preinnestandola con etanolo al 70%. Rimuovere l'etanolo preinnestando con acqua sterile.

Inserire l'estremità della cassetta di dispensazione nel pallone in modo che si trovi appena sopra la barretta magnetica senza interferire con il suo movimento. Assicurarsi che i vermi rimangano sospesi in tutto il pallone. Programmare il distributore per erogare i vermi a bassa velocità con due preimpulsi di priming ed erogare almeno 10 millilitri di vermi in sospensione.

Riempire rapidamente le piastre a microtitolazione, che dovrebbero già contenere i composti in prova, per evitare che i vermi si accumulino nei tubi. In questo caso, il composto in prova precedentemente caricato sulla piastra a microtitolazione è Glow. Sigillare le piastre con nastro traspirante per impedire l'accumulo di polvere nelle pozzette.

Posizionare le piastre su una piattaforma agitata all'interno di un incubatore alla temperatura appropriata per il saggio. Non impilare le piastre poiché ciò potrebbe ostacolare il flusso d'aria. Inserire la piastra bersaglio in un lettore per micropiastre per misurare l'intensità di fluorescenza di ogni pozzetto con le lunghezze d'onda di emissione ed eccitazione appropriate.

I filtri utilizzati per la GFP prevedono un'eccitazione a 485 e un'emissione a 528. I filtri per la RFP prevedono un'eccitazione a 540 e un'emissione a 590. Dopo aver letto la piastra, calcolare il rapporto tra GFP e RFP e normalizzare con le letture dei pozzetti di controllo, che non contengono il composto attivatore, per determinare l'esatto incremento del valore dell'intensità di fluorescenza derivante dai singoli trattamenti.

Il saggio SSKN qui mostrato utilizza un reporter doppio integrato a livello cromosomico, una ceppa in cui i vermi sono stati contati manualmente mediante microscopio stereoscopico. Il numero di vermi ha mostrato una correlazione con il volume dispensato, con un valore R quadro di 0,94 e un valore p inferiore a 0,0001. Ciò indica che il numero di vermi dispensato in ciascun pozzetto può essere controllato regolando il volume dispensato.

La fluorescenza GFP totale per pozzetto mostrata a sinistra e la fluorescenza RFP per pozzetto mostrata a destra sono altamente riproducibili da pozzetto a pozzetto su una piastra da 3 84 pozzetti in queste figure. Le XS indicano la fluorescenza relativa misurata in ciascun pozzetto. Le linee continue indicano le medie e le linee tratteggiate indicano tre deviazioni standard sopra o sotto la fluorescenza media di tutti i pozzetti, con un coefficiente di variazione inferiore al 9%. Come mostrato in questa figura, la fluorescenza GFP proveniente dal promotore GST quattro è linearmente correlata alla fluorescenza RFP proveniente dal promotore DOP tre su 3 84 pozzetti, con un valore di R quadro di 0,62 e un valore p inferiore a 0,0001.

Pertanto, il reporter RFP non inducibile può essere utilizzato per normalizzare il reporter GFP inducibile. Quando si esprime, il rapporto tra la fluorescenza GFP e RFP diventa altamente riproducibile da pozzetto a pozzetto su una piastra da 3 84 pozzetti.

Il calcolo del rapporto tra GFP e RFP ha ridotto il coefficiente di variazione al di sotto del 6%, dimostrando la capacità del reporter RFP con tre promotori DOP di ridurre la variabilità, come mostrato qui. L'induzione di GFP rispetto a RFP mediante un xenobiotico attivante SK N uno è robusta e altamente riproducibile su una piastra 3 84 pozzetti; i rapporti medi di fluorescenza relativa di tutti i pozzetti di controllo e dei pozzetti dovuti a GLO sono indicati con linee continue. Tre deviazioni standard al di sopra della media del controllo e al di sotto della media dlo sono indicate con linee tratteggiate.

Una volta acquisita padronanza, l'allestimento di una coltura di vermi richiede circa un'ora il primo giorno, per la messa in coltura e la distribuzione. La raccolta e la distribuzione dei vermi possono essere completate in circa due ore se eseguite correttamente. È importante ricordare, durante il tentativo di questa procedura, di iniziare con almeno 60.000 vermi e di mantenerli in sospensione durante la distribuzione; seguendo questo protocollo, schermate con altri ceppi, ad esempio ceppi reporter per altre vie inducibili, possono essere effettuate al fine di sviluppare modulatori per altre vie dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nei settori dello screening ad alto rendimento e del biosensing, consentendo di identificare rapidamente modulatori di percorsi molecolari di piccole dimensioni o di rilevare contaminanti ambientali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare, distribuire e misurare ceppi fluorescenti di elegans per lo screening ad alto rendimento di percorsi trascrizionali inducibili o per testare più campioni alla ricerca di contaminanti ambientali.