Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine ​​dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Oltre 60 milioni di persone sono state infettate dall'HIV, il virus che causa l'AIDS. L'HIV AIDS rappresenta una crisi sanitaria globale, e sebbene gli sforzi di ricerca intensivi abbiano notevolmente prolungato la vita delle persone infette, un vero vaccino rimane elusive. Un obiettivo principale della ricerca sui vaccini contro l'HIV è la glicoproteina dell'involucro, che l'HIV utilizza per entrare nelle cellule bersaglio.

In questo video, mostriamo come otteniamo le strutture di questa importante proteina utilizzando una tecnica di imaging chiamata tomografia crioelettronica. Partendo dall'HIV purificato, illustriamo i passaggi per la preparazione di campioni congelati, i passaggi per la registrazione di immagini al microscopio elettronico da questi campioni congelati e i passaggi per convertire tali immagini in modelli strutturali che potrebbero essere utili per la progettazione di vaccini contro l'HIV/AIDS. Un aspetto unico di quanto presentiamo in questo video è che il lavoro sarà dimostrato da membri del suo laboratorio che coprono un'ampia gamma di età, dagli studenti delle scuole medie e superiori fino agli studenti universitari e laureati, per arrivare a ricercatori postdottorandi e scienziati senior.

La preparazione di campioni di virus vetrificati adatti alla tomografia crioelettronica avviene spargendo una sospensione acquosa di virus all'interno di piccoli fori presenti in un film di carbonio supportato da una griglia di rame, e successivamente congelando rapidamente i virus. L'obiettivo di questo passaggio è preparare un campione congelato di virus integri, catturati in uno stato prossimo a quello nativo. Per iniziare, le griglie vengono posizionate all'interno di un'unità per scarica al plasma.

Questo dispositivo pulisce le griglie esponendole a un gas ionizzato. Ora che le griglie sono pronte per l'uso, viene preparata una sospensione di virus mescolata con piccole particelle d'oro. Queste particelle sono essenziali per la raccolta e l'elaborazione dei dati.

Successivamente, una goccia di sospensione virale viene posta sulla griglia appena pulita al plasma. La griglia viene quindi caricata in un robot, che la tampona con carta da filtro, riducendo la goccia a un sottile film liquido. Il campione viene poi immerso nell'etano liquido, che congela rapidamente i virus a una velocità superiore a 100.000 kelvin al secondo.

La griglia congelata per immersione viene quindi trasferita in una scatola di conservazione per il trasporto al microscopio. Questa procedura viene ripetuta fino a quando non si ottiene il numero desiderato di griglie congelate. Ora che le griglie con il campione virale sono pronte, il passaggio successivo consiste nel caricarle nel microscopio.

Per l'acquisizione delle immagini, questa operazione può essere eseguita manualmente o con l'ausilio di robot. Quando le griglie campione vengono caricate manualmente, l'utente si trova presso una stazione specializzata dove i campioni possono essere manipolati in atmosfera di azoto liquido; i campioni vengono quindi inseriti in una camera portatile raffreddata ad azoto, che viene sigillata, evacuata e infine collegata al microscopio. I microscopi più recenti sono in grado di effettuare un caricamento del campione più automatizzato.

Qui, in un microscopio Titan Cryos, i campioni congelati vengono consegnati al microscopio dall'utente e successivamente caricati automaticamente con le griglie del campione inserite nel microscopio. Ogni griglia può essere esaminata dall'utente prima di iniziare l'acquisizione delle immagini. I parametri del microscopio vengono impostati per ciascuna area della griglia del campione che presenta caratteristiche di interesse.

In questo caso, le caratteristiche sono virus HIV. Man mano che viene definita una nuova area, il computer del microscopio memorizza i parametri di imaging specifici per quell'area. Quando l'utente ha definito tutte le posizioni di interesse, il computer rivisita automaticamente ciascuna posizione e acquisisce un insieme di dati.

Ogni set di dati viene raccolto inclinando la griglia del campione rispetto al fascio di elettroni, assicurandosi al contempo che il fascio rimanga focalizzato sullo stesso punto della griglia. La raccolta dati in microscopia elettronica ha tradizionalmente richiesto agli utenti di stare seduti al microscopio e interagire fisicamente con l'apparecchiatura. Questo tipo di interazione con il microscopio è mostrato qui durante una visita del presidente Obama a una fabbrica di Intel.

I recenti progressi nelle interfacce informatiche dei microscopi consentono ora agli utenti di monitorare e regolare in tempo reale la raccolta dati da un computer remoto situato in laboratorio o altrove. Per visualizzare le forme dell'involucro e delle sporgenze proteiche, è necessario mediare le informazioni provenienti da centinaia di immagini individuali al fine di potenziare il segnale. Si tratta di un processo che richiede un elevato sforzo computazionale, realizzato in questo caso mediante l'utilizzo di un cluster di computer denominato Bio Wolf.

Situato presso il NIH, sono stati sviluppati metodi potenti per estrarre volumi individuali e mediare le informazioni utilizzando algoritmi in grado di operare a livelli di rumore elevati. Intrinseci a questo tipo di dati, le mappe di densità ottenute sia da virus nativi che da virus complessati a molecole biologicamente importanti forniscono una ricca base di dati sull'aspetto strutturale della biologia dell'HIV. Le mappe di densità assumono dettaglio molecolare quando i dati vengono combinati con informazioni provenienti dalla cristallografia a raggi X delle singole subunità che compongono lo spike della glicoproteina dell'involucro.

I dati provenienti da queste tomografie possono essere molto densi e difficili da interpretare. Un software 3D utilizzato nell'industria dell'intrattenimento può essere impiegato per visualizzare i modelli tridimensionali aggiungendo colori, texture e illuminazione, rendendoli più facili da analizzare. I software di visualizzazione comunemente utilizzati includono Mirror 3D Studio Max e Maya.

Abbiamo appena illustrato procedimenti passo dopo passo su come si possono ottenere modelli molecolari della struttura della glicoproteina dell'involucro, a partire da HIV purificato. Utilizzando questo metodo, abbiamo inoltre determinato le strutture della glicoproteina dell'involucro in complesso con una varietà di molecole che possono legare e sfruttare il virus.

Qui mostriamo un esempio della struttura della glicoproteina dell'involucro in complesso con un anticorpo chiamato B12. Comprendere perché alcune molecole possono legarsi e utilizzare il virus mentre altre no è molto importante per la progettazione razionale dei vaccini. Determinare le strutture molecolari delle glicoproteine dell'involucro dell'HIV o di altri virus, come l'influenza e l'Ebola, è fondamentale per comprendere l'ingresso e l'utilizzo virale.

Come hai visto, la tomografia crioelettronica sta emergendo come uno strumento potente per raggiungere questo obiettivo.