Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo per ottenere una struttura tridimensionale di molecole assemblate di heli mediante microscopia elettronica a criogenia. Il protocollo inizia con la preparazione del campione per microscopia elettronica a criogenia, utilizzando un metodo di diluizione rapida e asciugatura dal lato opposto per ridurre transitoriamente la concentrazione di sale durante la preparazione della griglia elettronica congelata e idratata. Questo processo garantisce la stabilità della proteina riducendo al contempo il rumore di fondo e migliorando il rapporto segnale-rumore durante l'acquisizione di dati a basso dosaggio in microscopia elettronica a criogenia che segue successivamente alla raccolta dei dati.

È completato l'indicizzazione elicoidale dei modelli di diffrazione. Successivamente viene eseguita l'elaborazione delle immagini, seguita dalla ricostruzione tridimensionale nello spazio reale, che porta alla mappa di densità finale del capside del virus dell'HIV o del tubo ca. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché esistono diversi punti critici per una raccolta e un'analisi ottimali dei dati.

Ad esempio, nel caso dell'HIV, si formano assemblaggi tubolari del capside che si sviluppano rapidamente in una soluzione madre unimolare riducendo la concentrazione di sale senza alterare la struttura. È fondamentale ottenere immagini di alta qualità mediante microscopia crioelettronica. Data un'immagine di un tubo, risulta molto difficile capire come procedere per indicizzare un tubo critico e quale software potrebbe essere utilizzato per effettuare la ricostruzione tridimensionale.

Questo video offre un approccio dettagliato e semplice per ottenere una ricostruzione tridimensionale di oggetti fisici e può essere utilizzato come riferimento per il tuo esperimento. Dimostrerò la procedura insieme alla dott.ssa Puja. Siamo entrambi ricercatori postdottorandi del laboratorio del dottor. Per preparare gli assemblaggi della proteina del capside dell'HIV per la microscopia crioelettronica, inizia con la scarica al plasma della faccia con rivestimento di carbonio delle griglie di rame da 200 mesh, applicando 25 milliampere per 25 secondi.

Utilizzare un nebulizzatore per portare l'umidità all'80% nella camera ambientale, che è un pistone manuale a gravità fatto in casa. Nel frattempo, raffreddare l'etano liquido in un pistone in vetro con azoto liquido, quindi montare il dispositivo per la congelazione immersione sul pistone manuale a gravità. Successivamente, utilizzare una pinza per chiudere le ganasce sul bordo della griglia.

Applicare 2,5 microlitri di una soluzione proteica preassemblata sul lato al carbonio della griglia. Successivamente, posizionare la pinzetta sul pistone con il lato al carbonio della griglia rivolto verso l'esterno. Aggiungere tre microlitri di tampone di diluizione a bassa salinità sul retro della griglia.

Asciugare immediatamente la griglia con un pezzo di carta da filtro sullo stesso lato. Mantenere l'intera superficie posteriore della griglia a stretto contatto con la carta da filtro per circa sei secondi. Dopo aver rimosso la carta da filtro, immergere immediatamente la griglia nell'etano liquido.

Infine, rimuovere la pinzetta dallo stantuffo e trasferire rapidamente la griglia in una scatola di conservazione per griglie. Iniziare la microscopia elettronica criogenica caricando la griglia congelata idratata in un microscopio elettronico FEI Polara G2, funzionante a 200 chilovolt e dotato di una telecamera CCD Gatan da 4K per 4K.

In modalità di ricerca a basso dosaggio, aggiungere un'ingrandimento di circa 200 x. Esaminare l'intera griglia alla ricerca di aree con ghiaccio adatto. Salvare le posizioni di queste aree in un file della piastra.

Ricordare le posizioni salvate ed esaminare ulteriormente queste aree. Impostare un ingrandimento di 3.900x in modalità di ricerca a basso dosaggio. Selezionare le aree con uno strato di ghiaccio uniforme e sottile per la raccolta dei dati, caratterizzate dalla presenza di lunghi tubi sospesi sopra un foro.

Salvare tutte le aree in un file di secondo stadio. Passare alla modalità di esposizione. Aggiungere un'ingrandimento di 59.000 x e inserire un diaframma obiettivo da 100 micrometri.

Quindi regolare lo stigma dell'obiettivo e l'intensità del fascio per una dose di circa 15 elettroni per angstrom quadrato per esposizione. Tornare alla modalità di ricerca a bassa dose e spostarsi su una posizione salvata. Identificare e centrare un buon tubulo.

Utilizzando la telecamera CCD, passare alla modalità di messa a fuoco, regolare il fuoco e impostare un valore di sfocatura normalmente compreso tra 0,5 e 2,5 micrometri. Successivamente, passare alla modalità di esposizione e impostare un tempo di esposizione di 0,3-0,5 secondi per una dose di 15 elettroni per angstrom quadrato. Acquisire le immagini con una camera a lastre, lasciando stabilizzare i film per 10 secondi prima di effettuare l'esposizione.

Dopo aver acquisito le immagini, passare alla posizione salvata successiva e ripetere questo processo per raccogliere ulteriori immagini. Sviluppare le pellicole con D 19 alla concentrazione piena per 12 minuti. Successivamente, digitalizzare le immagini utilizzando uno scanner Nikon Super cool scan 9.000 ED con una dimensione del pixel di 6,35 micrometri.

Un oggetto elicoidale può essere indicizzato mediante due parametri: l'ordine di Bessel N e il numero di linea di strato L nella trasformata di Fourier del reticolo superficiale di un oggetto elicoidale. Ogni linea di strato è caratterizzata da N e L e corrisponde a un insieme di linee sul reticolo superficiale indicato dagli indici H e K.

Per iniziare l'indicizzazione elicoidale, utilizzare il programma Helix boxer di Iman per delimitare un tubo relativamente lungo e dritto con diametro uniforme e salvare l'immagine in formato MRC. Successivamente, misurare il raggio del tubo utilizzando il programma boxer di Iman. Determinare la distanza del ripetizione dell'elica (HEL) mediante un programma basato sulla correlazione incrociata, come I-M-G-C-C-F nel pacchetto MRC.

Quindi calcolare il foyer. Trasformare con una nuova lunghezza della scatola che sia un multiplo intero della distanza di ripetizione. Successivamente, scegliere due linee principali del reticolo che definiscono due vettori fondamentali del reticolo superficiale, uno zero e zero uno, in unità di pixel della FFT.

Determinare i numeri delle linee stratificate e i raggi di massima ampiezza per le due linee stratificate principali nella trasformata di Fourier. Dati i numeri delle linee stratificate e i valori degli ordini di Bessel per le due linee stratificate principali, la rotazione tra le sottounità e l'avanzamento assiale dell'elica monostellata possono essere ottenuti utilizzando la regola di selezione descritta nella procedura scritta. Questi due numeri reali descrivono la simmetria elicoidale del tubo.

La ricostruzione 3D inizia con la segmentazione delle particelle utilizzando il programma Iman.Boxer. Dopo aver aperto una micrografia contenente particelle elicoidali, tagliare una particella in segmenti sovrapposti nel pannello di controllo di Boxer. Selezionare la modalità elica e impostare i parametri per il delimitamento.

La dimensione della scatola dovrebbe essere maggiore del diametro della particella e il valore per OLA dovrebbe essere circa il 90% della dimensione della scatola. Dopo aver fatto clic su una delle due estremità della scatola della particella, verrà generata automaticamente una serie di scatole di particelle lungo la lunghezza dell'elica, salvando sia i segmenti delimitati che le loro coordinate. Il passo successivo consiste nell'eseguire una ricostruzione tridimensionale iniziale utilizzando il metodo di ricostruzione iterativa nello spazio reale elicoidale, noto come I-H-R-S-R, prima dell'elaborazione con I-H-R-S-R.

Invertire il contrasto delle immagini di microscopia elettronica criogenica ed applicare un filtro PASSA-BASSO. Successivamente, aprire l'interfaccia grafica del programma I-H-R-S-R digitando generator. Fornire all'interfaccia grafica tutte le informazioni relative allo stack delle particelle selezionate, inclusi il nome e il percorso dello stack, il numero di immagini nello stack e i valori dei parametri di simmetria.

Fare clic sul pulsante di completamento per creare lo script di ricostruzione. B 25 SP.I utilizza un cilindro solido o cavo come riferimento iniziale e permette al procedimento di ciclare finché non si verificano più variazioni nella simmetria a vite definita, il che di solito avviene dopo alcuni cicli. Una simmetria elicoidale destrorsa dovrebbe fornire una ricostruzione stabilmente convergente.

La ricostruzione generata nell'ultimo ciclo verrà utilizzata come riferimento iniziale per un'ulteriore affinamento. Infine, eseguire la ricostruzione tridimensionale con affinamento iterativo utilizzando la mappa di densità 3D generata da I-H-R-S-R come riferimento iniziale per un affinamento aggiuntivo durante il processo di affinamento. La simmetria elicoidale è fissata all'angolo di rotazione tra le sottounità e all'avanzamento assiale, che sono determinati a partire dalla procedura I-H-R-S-R.

Successivamente, determinare la defocalizzazione e l'astigmatismo presenti nella microfotografia utilizzando i programmi CTF find three e CTF tilt mediante programmi spider denominati FT e mu moltiplicando i segmenti delle particelle per la funzione di trasferimento del contrasto. Abbreviato CTF, eseguire l'allineamento per proiezione confrontando le proiezioni dei volumi di riferimento con le immagini corrette per la CTF utilizzando un allineamento multiplo di riferimento. La variazione dell'angolo di inclinazione fuori dal piano è limitata a più o meno 10 gradi ed è campionata con passi di un grado; si introducono vincoli come coefficienti di correlazione elevati per angoli nel piano prossimi a zero gradi o 180 gradi e spostamenti X limitati.

Per i parametri di allineamento di ciascun segmento, includere nella ricostruzione solo quei segmenti che soddisfano i vincoli. Dopo ogni ciclo di affinamento iterativo, viene generata una ricostruzione 3D mediante retroproiezione e divisa per il quadrato della CTF, quindi viene imposta la simmetria elicoidale per generare un volume con simmetrie. L'affinamento iterativo termina quando non si verifica alcun ulteriore miglioramento nella risoluzione della nuova ricostruzione 3D.

Un singolo assemblaggio del capside di HIV, un tubo di 92 e, è stato delimitato e la sua trasformata di Fourier è stata calcolata per l'indicizzazione elicoidale dei due raggi; sono stati determinati i numeri delle linee layer e i raggi di ampiezza massima per le linee layer uno zero e zero uno. Sono stati quindi calcolati i valori finali di meno 12 e 11 rispettivamente per uno zero e zero uno, con una distanza di ripetizione di 5195,48 angstrom. La simmetria elicoidale del tubo è stata determinata come delta Z uguale a 6,81 angstrom e delta cinque uguale a 328,88 gradi; delta Z e delta cinque sono stati affinati a 7,13 angstrom e 328,86 gradi utilizzando I-H-R-S-R ed è stata generata una ricostruzione iniziale dopo 10 cicli iterativi.

La ricostruzione finale, dopo un affinamento iterativo, ha migliorato in modo significativo la mappa di densità rispetto al modello iniziale calcolato con I-H-R-S-R. La mappa di densità dei tubi di assemblaggio del capside è mostrata come tre sezioni ortogonali parallele all'asse del tubo e vicine alla superficie, perpendicolari all'asse del tubo e parallele e passanti attraverso l'asse del tubo. La struttura visualizzata deriva da una rappresentazione superficiale della mappa tridimensionale di densità, contornata a 1,8 Sigma e che racchiude il 100% del volume.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere una struttura 3D di una molecola assemblata in modo allelico utilizzando la microscopia elettronica criogenica.