Trasduzione di cellule umane con Polymer-complessato Lentivirus Ecotropic per Enhanced biosicurezza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è introdurre oncogeni o altri geni potenzialmente pericolosi in cellule umane mediante lentivirus ecotropici. Ciò si ottiene producendo un lentivirus pantropico, che codifica per il recettore del retrovirus murino, insieme a un lentivirus ecotropico che codifica per il gene d'interesse. Le cellule vengono quindi trasdotte con il recettore del retrovirus murino, rendendole suscettibili alla trasduzione con il virus ecotropico. Successivamente, le cellule vengono trasdotte con il virus ecotropico al fine di introdurre l'oncogene, utilizzando la complessazione polimerica con polibrene e solfato di condroitina per potenziare la trasduzione. I risultati ottenuti mostrano una trasduzione selettiva delle cellule umane con lentivirus tropici, basata su microscopia fluorescente e analisi FACS.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasduzione con retrovirus gamma, è che le particelle lentivirali possono trasdurre in modo più efficace molti tipi cellulari, inclusi le cellule non proliferanti come le cellule staminali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sul cancro e sulle cellule staminali, ad esempio comprendere la funzione di potenziali oncogeni. Prima di iniziare questa procedura, consultare l'addetto alla sicurezza della propria istituzione e seguire le linee guida sulla sicurezza da questi raccomandate.

Iniziare con una coltura di cellule 293T sane e in rapida crescita, lavorando in una cappa a flusso laminare. In condizioni asettiche, risospendere 5 × 10⁶ cellule 293T in 10 millilitri di mezzo per cellule 293T senza antibiotici. Pipettare la sospensione cellulare in una piastra per colture tessutali da 10 centimetri e incubare la piastra durante la notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di anidride carbonica.

Il giorno successivo, iniziare la trasfezione nel tardo pomeriggio. Per prima cosa, prelevare un'aliquote di Optum e dei plasmidi di trasferimento, confezionamento ed envelope, e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Pipettare 375 microlitri di Optum in una provetta da microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri di reagente di trasfezione FU gene HD. Assicurarsi che il reagente FU gene venga pipettato direttamente nel mezzo e non entri in contatto con le pareti della provetta.

Successivamente, in un secondo tubo da microcentrifuga, unire cinque microgrammi del plasmide di trasferimento, 3,75 microgrammi del plasmide di impacchettamento e 1,25 microgrammi del plasmide dell'involucro nella quantità necessaria di OptiMEM per portare il volume a 100 microlitri. Quindi aggiungere la miscela OptiMEM al tubo contenente la miscela di plasmidi e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante gli ultimi minuti dell'incubazione, aspirare molto delicatamente il mezzo dalla piastra contenente le cellule 293T e sostituirlo con 10 millilitri di mezzo fresco per cellule 293T privo di antibiotici.

Infine, aggiungere a gocce il mix di plasmidi del gene FU nel mezzo della piastra da 10 centimetri. Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per tutta la notte. Il giorno successivo, aspirare molto delicatamente il mezzo dalla piastra e sostituirlo con mezzo 2 9 3 T fresco privo di antibiotici.

Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per colture cellulari e incubare per altri due giorni. A tre giorni dalla trasfezione, aspirare il mezzo contenente il virus dalla piastra e filtrarlo utilizzando un filtro con bassa capacità di legame proteico da 0,45 micron. Dopo il filtraggio, concentrare il virus; effettuare diluizioni seriali di un virus controllo fluorescente in mezzo fresco privo di antibiotici contenente sei microgrammi per millilitro di polibrene e utilizzare queste diluizioni per trasdurre le cellule della linea cellulare appropriata. Il giorno successivo, in una piastra a 24 pozzetti, sostituire il mezzo con mezzo fresco privo di antibiotici, quindi proseguire l'incubazione per altri due giorni per consentire alle cellule di esprimere la proteina fluorescente.

Utilizzare i dati ottenuti per determinare la frazione di cellule transdotte per ogni diluizione virale. Calcolare quindi il titolo in unità trasformanti per millilitro in base alle diluizioni che producono una transduzione inferiore al 15%, al fine di minimizzare gli eventi di transduzione multipla. Si presume che il titolo di altri lentivirus non fluorescenti prodotti in parallelo sia simile a quello del virus fluorescente.

Per trasdurre le cellule bersaglio, iniziare selezionando una molteplicità di infezione maggiore di due per garantire che la maggior parte delle cellule venga trasdotta. Diluire prima il supernatante virale alla molteplicità di infezione richiesta in mezzo di coltura completo fresco, aggiungendo sei microgrammi per millilitro di polibrene fino a un volume finale di un millilitro.

Aspirare il mezzo da una piastra di 35 millimetri contenente le cellule bersaglio e aggiungere un millilitro di surnatante virale diluito. Incubare nell'incubatrice per colture cellulari per 24-48 ore per consentire un'espressione sufficiente del recettore SLC seven A one, se desiderato. Utilizzare la selezione antibiotica con blaster sein per selezionare le cellule transdotte stabilmente che esprimono SLC seven A one, seguendo le istruzioni riportate nella procedura scritta.

Per iniziare la determinazione della tossicità, preparare una soluzione madre di 20 milligrammi per millilitro di solfato di condroitina e una soluzione madre di 20 milligrammi per millilitro di poly brain in acqua, quindi filtrare in modo sterile. Le soluzioni madri in eccesso possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Successivamente, determinare il numero di colture cellulari in piastre a 96 pozzetti necessarie per valutare con precisione la tossicità del complesso polimerico. Mediante il saggio MTT, almeno sei concentrazioni di solfato di condroitina e poli verde devono essere testate in triplice replicato. Inoltre, includere cellule non trattate e cellule coltivate in assenza di siero.

Occorre includere un mezzo di controllo per fornire una linea di base per cellule sane e per controllare rispettivamente l'arresto della crescita. Una volta determinato il numero di pozzetti necessari, seminare 5.000 cellule bersaglio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, seminando parallelamente le cellule in una piastra a 24 pozzetti per l'analisi microscopica o basata su dati dell'efficienza di trasduzione in ciascuna condizione sperimentale; lasciare crescere entrambi i gruppi di cellule per tutta la notte. Il giorno successivo, prelevare un'aliquote della soluzione stock di solfato di condroitina e un'aliquote della soluzione stock di polibrene.

Quindi diluire il virus che codifica per GFP in un mezzo privo di antibiotici contenente sei microgrammi per millilitro di polibrene, a una multiplicità di infezione sufficiente a trasdurre circa il 10-50% delle cellule bersaglio per pozzetto. Assicurarsi che vi sia abbastanza virus diluito per ciascuna condizione di prova più i pozzetti di controllo su ogni piastra. Etichettare un insieme di provette con ciascuna concentrazione di solfato di condroitina e polimero poliverde da testare.

Quindi aliquotare una quantità sufficiente della sospensione virale per ciascuna condizione, in triplice replicato, nei tubi. Successivamente, pipettare il volume richiesto di soluzione madre di solfato di condroitina e poli-brain per ottenere le concentrazioni di prova in ciascuno dei tubi in successione. Immediatamente dopo l'aggiunta di solfato di condroitina e poli-green, agitare brevemente il tubo per mescolare.

Lasciare incubare le miscele di virus, condroitin solfato e verde poli a temperatura ambiente per cinque minuti. La miscela può diventare torbida con la formazione di precipitati virali. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo dalle pozzette della piastra a 96 pozzette.

Quindi aggiungere la miscela di virus, condroitin solfato e poli verde alle pozzette come previsto. Pipettare anche il controllo e il mezzo privo di siero nelle pozzette appropriate. Ripetere il procedimento per la piastra a 24 pozzette e incubare tutta la notte nell'incubatore per colture cellulari.

Successivamente, aspirare il mezzo contenente il virus dalle piastre e sostituirlo con mezzo fresco. Rimettere le piastre nell'incubatore per 48 ore. Dopo 48 ore, rimuovere la piastra a 24 pozzetti e utilizzare i dati per analizzare l'efficienza di trasduzione di ciascuna concentrazione di solfato di condroitina e poli-cervello.

Il giorno seguente. Aspirare il mezzo da tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con 100 microlitri di soluzione di MTT per tre ore in un incubatore umidificato, in modo che il MTT venga ridotto nei mitocondri delle cellule metabolicamente attive. Dopo tre ore, aspirare la soluzione di MTT e sostituirla con 200 microlitri di soluzione solvente.

Incubare la piastra per due ore a temperatura ambiente o fino a quando tutto il formazionepurpura di MTT e il precipitato si saranno sciolti. Leggere l'assorbanza con un lettore per micropiastre a 570 nanometri, sottraendo la lettura di fondo a 690 nanometri. La concentrazione ottimale del polimero produrrà un massimo miglioramento della trasduzione, determinato da dati sperimentali, con effetto minimo sull'attività metabolica, determinato tramite MTT per hdfs.

100 microgrammi per millilitro di solfato di condroitina. Poly brain è la concentrazione ottimale del polimero determinata mediante questo metodo. Preparare innanzitutto una quantità sufficiente di miscela di solfato di condroitina poli verde virale sup natant a 100 microgrammi per millilitro per trasdurre il numero richiesto di piastre da 35 millimetri di cellule HDF esprimenti il recettore SLC sette A uno. Incubare la miscela per cinque minuti per consentire la formazione dei complessi polimerici.

Quindi aspirare il mezzo dalle cellule target che esprimono il recettore e sostituirlo con la miscela virale, incubando tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver rimosso la miscela virale, lavare due volte la superficie delle cellule con PBS per facilitare l'eliminazione dei complessi virali. La rimozione completa non è necessaria, poiché non sono stati osservati effetti avversi sulla salute cellulare derivanti da complessi polimerici residui.

Questa immagine al microscopio a fluorescenza illustra una trasduzione sufficiente di cellule di sarcoma umano che esprimono stabilmente SLC seven A one con virus tropico, quando si utilizzano vettori di controllo fluorescenti per monitorare l'efficienza di trasduzione. La quantificazione della fluorescenza mediante analisi fax dimostra un'efficienza di trasduzione superiore al 90%. I tassi di trasduzione degli HDFS sono generalmente più bassi perché le cellule non sono state attivate né selezionate per l'espressione del recettore; i titoli di lentivirus atropico sono generalmente del 10-20% rispetto al virus pseudo-tipizzato VSV misurati su S-L-C-H-S-C. Il saggio di vitalità MTT consente una rilevazione sensibile dell'arresto della crescita nelle cellule bersaglio, come osservato in questo caso dopo trasduzione con virus e concentrazioni di solfato di condroitina.

Polibraio fino a 800 microgrammi per millilitro non ha alcun effetto sul metabolismo dei HDF. Analisi fax di HDFS transdotti con virus più varie concentrazioni di solfato di condroitina. Poliverde mostra un potenziamento della transduzione rispetto a Poliverde da solo.

L'incremento massimo si verifica a 100 microgrammi per millilitro. Il poli-solfato di condroitina del cervello è di diversi ordini di grandezza inferiore ai valori precedentemente riportati. Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per ogni tipo cellulare specifico in merito alla complessazione con il solfato di condroitina.

Poly brain aumenta il titolo osservato, circa di tre volte in S-L-C-H-S-C. In pratica, questo produce un effetto maggiore sull'efficienza di trasduzione a basse concentrazioni di virus rispetto a concentrazioni più elevate, il che è molto probabilmente dovuto alla presenza di cellule trasdotte multiple e alla saturazione dei recettori a concentrazioni elevate di virus. La trasduzione con virus tropici è specifica per le cellule che esprimono il recettore per retrovirus neuronali.

Quando si trasduce cellule umane non modificate con virus tropici, una fluorescenza superiore al fondo non ridotto non è stata osservata, come evidenziato dall'analisi al microscopio a fluorescenza. Gli HDFS non mostrano alcuna trasduzione in assenza di recettore, mentre la pre-trasduzione con il recettore determina cellule fluorescenti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di verificare che il virus non trasduca cellule umane modificate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare lentivirus tropici per trasferire geni potenzialmente pericolosi in cellule umane, inclusa l'uso della complessazione con polimeri per migliorare la trasduzione.