Metodo di particelle agglutinazione per l'identificazione Poliovirus

L'obiettivo generale della seguente procedura è identificare rapidamente isolati del virus della poliomielite utilizzando un protocollo semplice. Per questo saggio, utilizziamo particelle di gelatina sensibilizzate rivestite con molecole chimere contenenti il dominio extracellulare del recettore umano del virus della poliomielite collegato alla porzione Fc della IgG2. Poiché queste particelle presentano un'affinità uniforme per tutti i sierotipi di isolati del virus della poliomielite, l'agglutinazione delle particelle avviene dopo l'incubazione con campioni contenenti qualsiasi poliovirus umano.

Tuttavia, se sono presenti anticorpi in grado di riconoscere il virus specifico isolato dal campione, avviene la neutralizzazione e viene impedita l'agglutinazione; utilizzando questo sistema sperimentale, l'identificazione rapida degli isolati di poliovirus può essere eseguita in una singola reazione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test di neutralizzazione convenzionale, è la semplicità della procedura e dell'interpretazione del risultato, con l'obiettivo di ridurre il lavoro richiesto e accelerare i tempi per ottenere i risultati. Per ricostituire gli anticorpi anti PV uno, PV due e PV tre, aggiungere 0,5 millilitri di acqua in ciascun flaconcino.

Quindi trasferire ogni soluzione di anticorpo in provette separate contenenti 4,5 millilitri di mezzo di mantenimento. Alcuni lotti di anticorpo anti PV sono forniti in forma ricostituita; per tali lotti di anticorpo anti PV, l'aggiunta di acqua per la ricostituzione non è necessaria.

Successivamente, preparare miscele uno a uno della soluzione anticorpale combinata con un volume finale di 3,6 millilitri in nuove provette etichettate. Ad esempio, mescolare 1,8 millilitri di anti PV uno con 1,8 millilitri di anti PV due. Per preparare una combinazione anti PV uno più PV due, ripetere questa operazione per ogni possibile combinazione a coppie e preparare anche una soluzione contenente tutti e tre i tipi di anticorpi mescolando insieme 1,2 millilitri di ciascun antisiero.

Dopo aver preparato le quattro miscele aggiungendo 720 microlitri di siero fetale bovino a ciascuna soluzione anticorpale. Questo aiuterà a ridurre l'agglutinazione non specifica delle particelle di gelatina da parte degli anticorpi durante il saggio. I pool di anticorpi possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino al loro utilizzo nel saggio di agglutinazione.

In questo saggio, utilizziamo particelle di gelatina liofilizzate rivestite con i domini extracellulari del recettore umano del virus della poliomielite e di IgG due domini FC di topo. Assicurarsi di utilizzare un unico lotto di particelle e non lotti diversi in un singolo esperimento per garantire la coerenza dell'immagine di agglutinazione; ricostituire le particelle aggiungendo 1,5 millilitri di buffer di ricostituzione a ciascuna provetta. Agitare delicatamente per mescolare bene.

Le particelle ricostituite possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane. Progettare innanzitutto il proprio esperimento in una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti. Per ogni campione, il pozzetto numero uno conterrà il virus da solo.

I pozzetti dal numero due al cinque conterranno il virus più una delle quattro soluzioni anticorpali miste. Assicurarsi di lasciare un pozzetto per un controllo negativo contenente solo mezzo di coltura, senza virus né anticorpi. Una volta preparata la piastra, aggiungere 12 microlitri della corretta soluzione anticorpale in ciascun pozzetto dalle righe due a cinque e 12 microlitri di mezzo di crescita.

Medio rispetto al virus da solo, nei pozzetti della riga uno e al pozzetto di controllo negativo della riga sei. Successivamente, aggiungere 12 microlitri di campione virale nelle prime cinque righe e 12 microlitri di terreno di crescita al pozzetto di controllo negativo della riga sei. Una volta che gli anticorpi e il virus sono stati aggiunti alle piastre, risospendere le particelle di gelatina ricostituite agitandole delicatamente e aggiungere immediatamente 25 microlitri di particelle per pozzetto in tutti i pozzetti.

È importante non permettere che le particelle si depositino prima di trasferirle nella piastra, al fine di ottenere quantità uguali di particelle in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra del saggio su un agitatore per piastre e mescolare per 30 secondi. Successivamente, posizionare la piastra su un foglio di carta bianca e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore, consentendo così l'agglutinazione.

È importante non spostare mai la piastra durante o dopo l'incubazione, poiché l'agglutinazione formata è instabile. Una volta avvenuta la reazione, scattare diverse immagini della piastra in cui sia possibile apprezzare la qualità dell'agglutinazione in ciascun pozzetto. Nei pozzetti in cui non si è verificata agglutinazione, come mostrato qui a sinistra, le particelle di gelatina colorate precipiteranno sul fondo del pozzetto, mentre nei pozzetti in cui si è verificata l'agglutinazione ciò non accadrà.

A causa dell'interazione tra il virus e le particelle di gelatina rivestite con IgG anti-pvr due A, è visibile un disegno colorato diffuso, come mostrato al centro. In questo esperimento, abbiamo verificato la capacità delle soluzioni virali, PV uno, due e tre, di indurre agglutinazione in presenza dell'anticorpo. Le combinazioni indicate, come mostrato qui, in assenza di virus o di anticorpi, non si verifica alcuna agglutinazione e le particelle di gelatina precipitano; al contrario, nella pozzetta contenente il virus ma in assenza di anticorpi.

Si è verificata un'agglutinazione a causa dell'interazione del virus. Con le particelle di gelatina rivestite con PVR IgG nei pozzetti sperimentali, l'agglutinazione dei virus viene impedita in tutti i pozzetti contenenti anticorpi che neutralizzano specificamente quel virus. Ad esempio, l'agglutinazione del poliovirus di tipo uno viene impedita nei pozzetti contenenti anticorpi anti-PV uno, ma non nei pozzetti contenenti solo anticorpi anti-PV due e anti-PV tre.

Lo stesso vale per i tipi due e tre del virus della poliomielite. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in appena tre ore se viene effettuata correttamente.