Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, identificare e purificare le cellule epiteliali del timo o la tecnologia. Ciò si ottiene prima enzimaticamente, digerendo e disgregando meccanicamente il timo per dissociare la tecnologia in una sospensione a singola cellula. Successivamente, la tecnologia può essere analizzata mediante citometria a flusso o arricchita tramite una strategia di panning.

In definitiva, i sottogruppi epiteliali del timo possono essere purificati mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a molte domande chiave nel campo dello sviluppo delle cellule T, come ad esempio, in che modo le cellule epiteliali timiche promuovono la selezione timica? Quali sono le cause della disfunzione timica negli animali che invecchiano e come possiamo ottenere la ricostituzione delle cellule T in vitro?

I principali vantaggi di questa tecnica sono l'elevato recupero di cellule germinali emmiche variabili, l'arricchimento imparziale delle cellule epiteliali emmiche e l'elevata purezza che può essere raggiunta con la selezione cellulare. Per isolare le cellule stromali del timo, identificare prima il timo, che si trova appena sotto le costole e assomiglia a due sottili lobi bianchi che sovrastano il cuore. Quindi scollegare il tessuto connettivo che circonda il timo e utilizzare una pinza seghettata curva per tirare e rimuovere delicatamente i lobi del timo.

Posizionare i lobi in una piastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di terreno e tagliare il grasso e il tessuto connettivo circostanti. Quindi trasferisci i lobi tagliati in un nuovo pozzetto contenente cinque millilitri di soluzione enzimatica appena preparata e usa le forbici sottili per praticare piccole incisioni nel tessuto. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Dopo 20 minuti, pipettare delicatamente il tessuto su e giù più volte con una pipetta da cinque millilitri per dissociare il liquame in una singola sospensione cellulare. Raccogliere la frazione surnatante in una provetta da 50 millilitri contenente 10 millilitri di tampone freddo ricco di albumina su ghiaccio per neutralizzare gli enzimi. Quindi aggiungere 2,5 millilitri di soluzione enzimatica al tessuto rimanente.

Incubare la piastra per 15 minuti. Successivamente, agitare delicatamente il tessuto con una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 18 geni per rompere eventuali aggregati. Quindi trasferire il file nella provetta di raccolta.

Quindi aggiungere 2,5 millilitri di soluzione enzimatica al tessuto rimanente. Incubare la piastra per 15 minuti. Dopo la terza incubazione, ripetere l'agitazione meccanica con un ago da 20 5G.

Dopo aver incubato il tessuto per gli ultimi cinque-10 minuti, trasferire il surnatante nella provetta di raccolta per la centrifugazione per identificare la tecnologia recuperata mediante citometria a flusso Seguendo le procedure standard di colorazione degli anticorpi, eseguire i campioni su un citometro a flusso multiparametrico e analizzare i dati utilizzando l'appropriato software di analisi fax per arricchire ulteriormente la tecnologia con il metodo di panning. Innanzitutto, incubare le cellule con l'anticorpo appropriato per l'arricchimento. Quindi, aggiungere la sospensione cellulare a una piastra di panning precodificata, quindi far roteare la piastra e incubarla a temperatura ambiente.

Dopo 30 minuti, agitare energicamente la piastra e poi trasferire il surnatante in un tubo conico. Sciacquare la piastra due volte con acqua fresca, media, raccogliendo i lavaggi nella provetta di raccolta. Quindi, dopo aver fatto girare le cellule, risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno fresco e trasferire la sospensione cellulare su una nuova piastra di panning, raccogliendo le cellule dopo averle fatte roteare e incubare, come appena dimostrato, per purificare ulteriormente la tecnologia arricchita nei loro sottoinsiemi di cellule timiche.

Dopo aver etichettato con gli anticorpi appropriati, selezionare la tecnologia attraverso un ugello da 100 micrometri mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, raccogliendo le cellule in 30% di volume per volume FBS in terreno. In questa strategia di gating rappresentativa per identificare la tecnologia mediante citometria a flusso, si può osservare l'espressione di epca, ma non di CD 45 da parte della tecnologia. Pertanto, la tecnologia può essere gated in base alla loro espressione ep, camm e CD 45 la tecnologia è composta da sottoinsiemi epiteliali timici corticali o CEC e midollari o mtech.

Questi sottogruppi possono essere distinti dall'anticorpo vivo 51, che riconosce la G glutamil amino peptidasi espressa da ctec e dalla lectina UEA, che si lega a mtech sia ctech che Mtech express MHC Class two sulle loro superfici. Sebbene mtech possa essere ulteriormente classificato in popolazioni mtech basse e mtech alte, a seconda del loro livello di espressione MHC due, circa otto volte più tech può essere recuperato utilizzando il protocollo basato sull'enzima liasi appena dimostrato rispetto a un protocollo con collagenasi e spazio discale, con circa nove volte 10 al quinto, in grado di essere recuperato da un solo timo di topo per ridurre il tempo di selezione e aumentare la vitalità del cellule stromali recuperate. Il panning può essere utilizzato, come appena dimostrato, per esaurire i siti dei timociti rispetto a intere cellule di timo preparate.

La percentuale di tecnologia aumenta da meno dello 0,5% a oltre il 15% nella popolazione cellulare post-arricchita. Dopo il panning, le proporzioni dei sottoinsiemi tecnici non vengono alterate, suggerendo che nessuno dei due sottoinsiemi viene perso selettivamente durante il panning. Rispetto al campione di arricchimento preen, il tasso di recupero della tecnologia è di circa l'85%Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come arricchire le cellule germinali teriche da più di panico, nonché di come identificare e purificare i subside epiteliali più temici mediante citometria a flusso.